用于表述培养液特征的方法和设备技术

一种用于表述培养液特征的方法，特别是表述在一个生物反应器中的培养液的特征的方法，其中通过对包含在所述培养液中的细胞（２２）进行照射，对细胞（２２）进行显微镜成像，并且通过对所述显微镜图像的评价，对所述培养液进行现场分析。所述照射是由暗场照射实现的，并且所述图像评价包括将从细胞内部和从细胞边缘发出的光的强度进行对比，通过所述对比来区分活细胞和死细胞（２２），以便确定所述培养液的活性。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种根据专利权利要求1的前序部分所述的方法，以及用于实现所述方法的设备。因此，光学检测器就很自然地被用于测量细胞对光的吸收、散射或者细胞所发出的荧光。不幸的是，通常这些方法不能区分细胞和其周围的液体。因此在密闭的生物反应器中很难获得关于细胞数量的详细消息。根据DE 40 32 002 C2的方法和设备因此构成了一个实质性的进步。在使用该方法的情况下，细胞被照射并且被一个显微镜和一个摄像机成像，该图像由电子图像处理技术进行分析。不需要进行细胞取样。类似于计数腔室，用光学或机械的方法确定显微体积。由图像处理技术对细胞进行有选择地检测，并且确定细胞的密度、尺寸和形态。细胞漂浮于其中的溶液、伴生物、杂质和空气泡可以可靠地与细胞区别开。在现场的显微镜检查提供了作为测量值的细胞密度和细胞尺寸分布。由这两个值可以确定干的生物量。然而，人们还想要得到的是确定培养液的活性。细胞样品的活性被定义为活细胞数除以总细胞数(活的和死的细胞的总和)的比值。对于工业规模的培养来说，活性是一个重要的参数。在这些工艺过程中，生物量被多次使用，直至死细胞分部变得很高，以致必须采用新的细胞培养为止。另一个应用的目的在于培养物的孕育处理如果细胞样品的活性和细胞密度是已知的，用于一种植培养物的孕育处理(例如酿造厂中加酵母菌)所需体积就可以计算出来。因此，如果借助于同一个样品可以确定绝对细胞密度和活性这将是一大进步。然而，至今还不能够对每个单独的细胞将细胞活性作为附加参数加以检测。达到此目的的所述方法和设备揭示在专利权利要求1和10中。在本专利技术的方法中，对细胞的照射采用的是暗场照射。在该照射装置中，形成图像的光线没有直接来自照射光源的光线，而仅有从被照射细胞发出的光，也就是说例如是散射光。在进行图像评价时，将细胞内部的发光强度与细胞边缘的发光强度进行比较。由此可以区分活细胞和死细胞，这样培养液的活性就可以被确定。所述方法利用了细胞折射光线的特性。活细胞让光线基本上对准向前的方向，而死细胞则漫射地将光线折射到所有方向上。如果采用一种对细胞折射光进行角度选择性检测的光学装置，也就是说一个暗场装置，并且将后者做成一个现场观测的显微镜，就可以在反应器中直接检测细胞活性。其他的优选改进结构将在权利要求2到9和11到20中明确说明。图2显示了带有变化的照射装置的第二实施例；图3显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供亮场显微镜检查；图4显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供荧光显微镜检查；图5显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供相位对比显微镜检查；以及图6显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供干涉对比度显微镜检查。在试样体积16的外侧安装一个显微镜物镜18，使该物镜18的光轴与管轴重合。在物镜18的与玻璃镜片12、14相对的一侧安装了一个电子图像记录器20，该图像记录器20的接收表面与物镜18的光轴呈现直角。从玻璃镜片14到物镜18的距离以及从物镜18到图像记录器34的距离是这样根据物镜18的焦距而选择的，以致一个物体，也就是说，特别是在试样体积16内的一个待检查的细胞22可以清晰地在图像记录器20的接收表面上成像。在玻璃镜片12、14的与物镜18和图像记录器20相对的一侧是一个带有一个基本为点状的光源26的暗场聚光器24、一个布置在物镜18的光轴上的凸镜28和一个以径向对称形式并且基本上环绕着所述光轴布置的凹镜30，在附图说明图1中该凹镜只被部分地显示出来。图1中所示的暗场聚光器24是所谓的心形聚光器。光源26的光线被凸镜28反射到凹镜30上，而凹镜30将光线反射成为一种弱会聚的旋转对称光束，与物镜18的光轴偏斜地进入到试样体积16中。因此，从凹镜30发出的光束在试样体积16中相互交叉并且在试样体积中射到细胞22上，从而使细胞得到照射。以下将描述图1中的装置的操作模式。为了使试样体积16中的培养液固定不动，管10壁上的开口被密封住，这样其流动被阻断。然后，将可移动的玻璃镜片14向固定的玻璃镜片12的方向上移动，直到这两个玻璃镜片12、14之间的空间足够小，以致使试样体积16仅由很薄一层液体形成。该层的厚度将对应着物镜18的景深，这样所有在试样体积16中的细胞22都能够清晰地成像。暗场聚光器24的光线射到细胞22上，但却并不直接传到物镜18中，因为后者被安装在暗场聚光器24的光路之外。因此，只有由被照射的细胞22所发出的光进入到物镜18中，并且所述的光在图像记录器20的光敏接收表面上产生了一个清晰的细胞22的图像。该图像被数字化并且由图像处理软件进行分析。为了将活细胞22和死细胞22区分开，利用了这样一个事实，即在通过暗场照射而进行所述的成像的情况下，活细胞的内部显得比其边缘暗得多，而死细胞的内部与其边缘基本上一样明亮。因此，借助于比较各细胞的边缘与内部的亮度通过图像处理方法，能够以一种简单的方式对培养液活性进行评估，从而在此基础上决定所涉及的细胞是活的还是死的，然后确定在总的细胞数中所占的活细胞的分额。如果细胞22仅在图像记录器曝光的时间内(约1/50秒)被短暂照射，可以不用通过密封开口来使试样体积16中的培养液固定不动，这样尽管有细胞22的运动，也能够产生清晰的图像。通过对光源26进行脉冲操作可以获得这种短暂的照射。例如，闪光灯、LEDs和激光都适合作为光源26。图2显示了一个与图1的装置相类似的第二实施例，该实施例包括一个带有多个点状光源32、34的暗场聚光器，其中两个对置的光源以示例的方式显示在图2中。这些光源32、34被配置成王冠状并且关于光轴旋转对称。其光线由透镜36、38聚焦到试样体积16中，这样就产生了一条与图1的心形聚光器18相对应的光路，其中这些透镜36、38的光轴相互交叉于试样体积16中的一点。图3显示了本专利技术的设备的另一实施例，该实施例除了可以进行暗场显微镜检查之外，同时还可以进行亮场显微镜检查。为此，该装置带一个聚光器24，所述聚光器24是一个带有一个基本上为点状光源26、一个凸镜28和一个环绕着显微镜的物镜18的光轴布置的凹镜30的装置，所述装置与图1所示的心形聚光器24相对应，可以进行在图1中所描述的对试样体积16的暗场照射。然而，与图1中所示的聚光器24不同的是，凸镜28被设计用来将一部分从光源26发出的光线反射到凹镜30上，而让其余部分的光线穿过。该透射的部分穿透地照射试样体积16，这样穿过培养液和细胞22的部分可以进入物镜18中，并且在图像记录器20上产生一个图像。这样，在图像记录器20上总共产生了两个图像一方面，是通过细胞22的暗场照射所形成的被照射细胞的图像，另一方面，是透过细胞22的亮场照射光线的透射图像。为了将这两个图像分离开，将一个分光立体块布置在显微镜物镜18和图像记录器20之间的光轴上，该分光立体块将一部分进入到分光器44的光线以垂直于光轴的方向反射。这条光线投射到与第一图像记录器20同样设置的第二图像记录器42上，以便生产一个图像并对其进行数字化处理。图像的处理要求从光学上将这两个图像相互分开。这一点是通过以下的方法完成的使两种类型照射的光线，也就是说，暗场照射和亮场照射的光线发生偏振本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表述培养液特征的方法，特别是表述在一个生物反应器中的培养液的特征的方法，其中通过对包含在所述培养液中的细胞（２２）进行照射，对细胞（２２）进行显微镜成像，并且通过对所述显微镜图像的评价，对所述培养液进行现场分析，其特征在于：所述照射是由暗场照射实现的，并且所述图像评价包括将从细胞内部和从细胞边缘发出的光的强度进行对比，通过所述对比来区分活细胞和死细胞（２２），以便确定所述培养液的活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗比特纳，
申请(专利权)人：因诺瓦蒂斯股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]