一种免疫检测信号放大系统和它的制备方法及其应用技术方案

本发明专利技术涉及蛋白的制备，尤其是应用偶合剂制作的免疫检测放大系统和它的制备方法及其应用。本发明专利技术是一种免疫信号放大系统，它包括葡萄球素蛋白Ａ（ＳＰＡ）与链霉素抗生物素（ＳＰ）的复合物，本系统的检测灵敏度更高，可以代替二抗，操作时间缩短，可与许多种属来源的一抗配用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白的制备，尤其是应用偶合剂制作的免疫检测放大系统和它的制备方法及其应用。
技术介绍
免疫检测技术是目前医学、生物学等领域最基本也是最常用的检测技术之一，它不仅广泛应用于医学生物学基础研究，也广泛应用于医学临床，甚至环境监测，在疾病诊断、疾病发展的预测、疾病治疗的反应性、病人预后的预测，甚至食品和环境微生物污染的监测中都具有十分重要的应用价值。免疫检测技术包括免疫组织化学技术、酶联免疫吸附技术(ELISA等)、免疫层析技术、免疫沉淀技术及免疫芯片技术等。不论是通过抗原检测抗体还是通过抗体检测抗原，所有这些技术是建立在抗原抗体反应基础之上的。免疫检测方法不仅特异性高，而且几十年来人们通过不断的探索，专利技术了一些免疫检测信号放大系统，如除使用能与目的抗原特异结合的第一抗体外，再加上信号放大系统，如加能与第一抗体结合的第二抗体，甚至在加生物素标记第二抗体后再加卵白素或链霉菌素抗生物素(strepavidin，在下文中称为SP)，或在加第二抗体后加过氧化物酶标记的葡萄球菌素蛋白A(staphylococal protein A，在下文中称为SPA)，使其免疫反应特异信号多次放大，从而大大提高了检测的灵敏度。目前最常用的免疫信号放大系统是SP放大系统(也有人称之为SLAB系统)，该信号放大系统在免疫组织化学检测中比传统的ABC法或PAP法等要敏感数倍至十几倍。即使如此，SP免疫信号放大系统对于非常微量的抗原如病原微生物的检测仍然无能为力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能用于多种免疫检测如免疫组织化学检测、酶联免疫吸附检测、免疫层析检测及免疫芯片等在内的免疫检测信号放大系统和它的制备方法及其应用。本专利技术所述的一种免疫信号放大系统，它包括葡萄球素蛋白A(SPA)与链霉菌素抗生物素(SP)的复合物。它的制备方法为1、活化生物素的制备●1.5-2.5mg生物素加入30ml-50ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，再依次加入0.5--2.5g琥珀酰亚胺脂和1-3.0g双乙基碳化二亚胺，室温下密闭磁力搅拌20-24小时，使其析出沉淀物。●减压过滤除去沉淀物，并滴加DMF洗涤数次，滤液置4℃过夜。●减压过滤除去沉淀物，滤液加热至100℃左右，减压抽去DMF后得到固体物质。●用少量乙醛洗涤数次，进一步除去双环乙基碳化二亚胺和减压除去溶剂DMF，得到活化生物素纯品。此纯品置4℃干燥保存。2、葡萄球菌素蛋白A(SPA)的生物素化1ml的SPA(0.01-0.03mg/ml)，用0.1mol/LNaHCO3调到PH8.5，加入2-3mg的活化生物素，室温搅拌60分钟，4℃过夜，然后用PBS缓冲液透析，0.2μm滤孔膜除菌。3、制备链霉菌素抗生物素(SP)按常规方法制备。简介如下Savidinil ATCC27419菌株培养液100ml，纱布过滤并离心，上清用6mol/LNaOH调到PH11，将10ml亚胺生物素-CL-Sepharose 4B加入1000ml上清中，25℃搅拌1小时，用砂芯漏斗抽滤，直到OD280nm＝0，将洗后的4B珠装柱，用PH4.0的PBS缓冲液洗下，再于4℃下用PH7.0的PBS透析。4、对SP进行标记，如用过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、同位素、荧光素等标记。HRP标记SP方法如下2-4mgHRP和4-8mgSP溶于1ml的0.1mol/L PH6.8的PBS中，与30--60μl的0.1％戊二醛水溶液混合，室温搅拌3小时后用PBS在4℃下透析48分钟，4℃下离心(300-4000r/分钟)30分钟，最后分装保存于-20℃之下。5、将生物素化的葡萄球菌素蛋白A与已标记的链霉菌素偶联成葡萄球菌素蛋白A与链菌素合物。5.1SPA-SP偶联的方法为(1)将SPA溶解于双蒸水或1.5％醋酸溶液中，SPA与液体的比例为1g∶1-1.8L，(2)SP溶解于0.1％PBS(PH7.5)或蒸馏水中，SP与液体的比例为10-15g∶1L；(3)将上述6LSPA溶液与1L的SP溶液振荡混匀，在搅拌中逐滴加入0.2％戊二醛1L，搅拌5-10分钟于室温下继续反应1-2小时。5.2SPA-SP偶联的方法为MBS法(1)将1-3mgSPA溶于0.5mlPBS中，透析，透析液加入MBS/DMF(每ml DMF中含15mg MBS)50-58ml，用PD-10层析柱层析；(2)将2-3mg SP溶于PBS中。然后与SPA溶液混合，再同蒸馏水透析过液。SPA-SP连接物置4℃保存供二次试验用。5.3SPA-SP偶联的方法为EDCI法将7-8mgSPA溶于1ml双蒸水中，加入EDCI40mg，用0.1mol/L Hcl调至PH4.5，加入双蒸水溶解的SP3-5mg/0.5ml，4℃透析过夜，冰箱保存。5.4SPA-SP偶联的方法为BDB法将SPA3-4mg溶于8-10ml PH9.0硼酸缓冲液中，加入SP1.5-1.8mg，缓慢加入0.1mlBDB，置4℃振荡2小时，用0.1mol/L NaoH调至PH9.0，倒转试管数次，低温冰箱中保存。本专利技术的原理为SPA蛋白能与人及许多动物的免疫球蛋白(Ig)结合，结合的部位是Ig的FC段。每个SPA分子可结合2个Ig分子，还可同时结合标记物如HRP、AP、荧光素、胶体金等。正因为如此，检测抗原时，如在加一抗后加SPA，可代替二抗并使检测的敏感性放大数倍(与二抗相比，SPA结合一抗的数量加一倍)。SP蛋白分子，其上有四个生物素结合位点，可结合四个生物素分子，所以采用SP可使原有的免疫检测敏感性提高几十倍。SPA与SP联结成SPA-SP复合后，使其将SPA和SP的优点集于一身；使其免疫信号的放大倍数大大提高。本专利技术的优点在于①与SP免疫信号放大系统和SPA免疫信号放大系统相比，其检测的灵敏度更高；②由于SPA-SP信号放大系统可以代替二抗，节省了二抗的费用；③由于SPA-SP信号放大系统可以代替二抗，所以与现有通用的免疫检测方法相比，操作时间缩短；④由于SPA不仅能与一抗(属Ig)结合，而且无种属特异性，所以可与许多种属来源的一抗(不论是单克隆抗体还是抗血清)配用，而现有的免疫检测系统中的二抗却不能。具体实施免疫信号放大系统，包括葡萄球素蛋白A(SPA)与链霉菌素抗生物素(SP)的复合物。制备方法1、制备活化生物素2、制备葡萄球菌素蛋白A-SPA的生物素化3、制备链霉菌素抗生物素SP4、对链霉菌素抗生物素进行标记 5、将生物素化的葡萄球菌素蛋白A与已标记过的链霉菌素偶联成葡萄球菌素蛋白A与链霉菌素复合物。实施例11、活化生物素的制备●2.5mg生物素加入30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，再依次加入1.5g琥珀酰亚胺脂和2.0g双乙基碳化二亚胺，室温下密闭磁力搅拌20-24小时，使其析出沉淀物。●减压过滤除去沉淀物，并滴加DMF洗涤数次，滤液置4℃过夜。●减压过滤除去沉淀物，滤液加热至100℃左右，减压抽去DMF后得到固体物质。●用少量乙醛洗涤数次，进一步除去双环乙基碳化二亚胺和减压除去溶剂DMF，得到活化生物素纯品。此纯品置4℃干燥保存。2、葡萄球菌素蛋白A(SPA)的生物素化1ml的SPA(0.02mg/ml)，用0.1mol/LNaHCO3调到PH8.5，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫信号放大系统，其特征在于它包括葡萄球素蛋白Ａ与链霉菌素抗生物素的复合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佐福，
申请(专利权)人：福州市迈新生物技术开发公司，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]