新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种新型冠状病毒N‑His重组蛋白芯片平台的构建方法，通过pET28a N质粒先制备有良好抗原性的N重组蛋白，然后再利用该N重组蛋白去确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度，最后用构建的芯片检测梯度稀释的血清确定好芯片的检测限和线性范围，由此去完成N基因重组蛋白芯片平台的构建。相对于RT‑PCR检测方法，本芯片具有更稳定的检测性能，还具有高通量、微型化等特点，不易受病毒变异的影响，可以更精准、快速的实现对2019‑nCoV大批量的筛查。

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法。
技术介绍
2019年12月下旬出现了一批不明原因的肺炎患者，后经对肺炎患者样本进行测序，发现了一种新型冠状病毒，随后命名为2019-nCoV。新型冠状病毒(2019-nCoV)患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。目前，该病没有特效治疗方法，潜伏期长，平均为14天，潜伏期内仍具有传染性，主要通过飞沫传播和接触传播，在密闭、不通风场所可能存在气溶胶传播风险。而部分患者无症状或起病症状不明显，极易导致漏诊并扩大感染范围。目前关于冠状病毒检测的分子诊断方法有RT-PCR、实时逆转录PCR(rRT-PCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)以及实时RT-LAMP，同时也可通过免疫荧光技术、中和抗体、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等检测病毒相关蛋白。现全国检测2019-nCoV的主要手段为RT-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)N重组蛋白抗原的制备：/n1.1)应用RT-PCR方法得到新型冠状病毒N基因PCR扩增产物，回收，纯化；/n1.2)酶切N基因PCR扩增产物，并使用T4连接酶连接pET28a载体，得到pET28a N基因载体；/n1.3)将pET28a N基因载体转化进入感受态大肠杆菌中培养；/n1.4)取步骤1.3)中的菌液，使用质粒抽提纯化试剂盒提取和纯化重组pET28a N质粒；/n1.5)通过PCR、酶切和测序的方法鉴定重组pET28a N质粒，将通过鉴定的重组pET28a N质粒转化进入感受态大肠杆菌中，并诱...

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)N重组蛋白抗原的制备：
1.1)应用RT-PCR方法得到新型冠状病毒N基因PCR扩增产物，回收，纯化；
1.2)酶切N基因PCR扩增产物，并使用T4连接酶连接pET28a载体，得到pET28aN基因载体；
1.3)将pET28aN基因载体转化进入感受态大肠杆菌中培养；
1.4)取步骤1.3)中的菌液，使用质粒抽提纯化试剂盒提取和纯化重组pET28aN质粒；
1.5)通过PCR、酶切和测序的方法鉴定重组pET28aN质粒，将通过鉴定的重组pET28aN质粒转化进入感受态大肠杆菌中，并诱导表达N蛋白；
1.6)鉴定步骤1.5)得到的N蛋白的抗原免疫活性；然后纯化和复性N蛋白，得到N重组蛋白抗原；
2)芯片的制作：
2.1)将步骤1.6)中得到的N重组蛋白抗原用点样仪点击到载片上；
2.2)用疏水笔将点好的载片上的不同杂交区隔离，待其干燥后固定载片，然后滴加封闭液进行封闭；
2.3)以新型冠状病毒血清作为第一抗体，稀释后与步骤2.2)中的N重组蛋白抗原进行第一次杂交，杂交后洗涤，然后再与荧光标记的第二抗体进行第二次杂交，杂交后洗涤并干燥，收集数据，利用方阵实验确定第一抗体和第二抗体的最佳稀释度；
2.4)用构建的芯片分析检测梯度稀释的新型冠状病毒血清，确定芯片的检测限及线性范围，完成新型冠状病毒N-His重组蛋白芯片平台的构建。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2.1)中，所述载片为氪基或环氧基修饰的玻璃载片。


3.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴东，黄丹，吴斌，黎东明，陈敏，李文，黄玉洁，招轩娜，黄球，刘伟良，袁亚连，
申请(专利权)人：广东医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：广东;44