基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置，该装置包括并行受激发射损耗显微模块和超临界角荧光探测模块，并行受激发射损耗显微以宽场激发和阵列损耗扫描样品成像，超临界角荧光探测模块通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个像素点的轴向位置信息。本发明专利技术装置简单，操作方便；保留了受激发射损耗显微镜高分辨率的特点；并行损耗和电光调制器的使用使得成像速度非常快，仅受相机的刷新速率限制，可用于观察活细胞；无需层切，仅通过对二维图像的算法处理还原三维信息，可快速有效的实现三维空间内的高分辨率显微成像。

【技术实现步骤摘要】
基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置
本专利技术涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于并行受激发射损耗显微镜(STED)和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置。
技术介绍
光学显微镜是生命科学等领域用于观察研究微观结构的重要手段。但是由于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，普通光学显微镜的分辨率被限制在半波长左右，无法对小于200纳米尺度的样品进行探测。为了突破这个限制，科学家们提出了多种超分辨成像技术方法，来实现对纳米级的微小结构的观察研究。另一类技术如随机光学重构和光激活定位显微镜，运用单分子定位技术实现超分辨显微成像。这类技术需要使用高强度的激光漂白已被正确定位的分子，且需循环上百次才能得到最终结果。所以这一类技术除了也存在和之前受激发射损耗显微术相同的限制以外，更具有因为成像速度慢而无法观测分子动态的缺点。结构光照明显微镜不同于之前提到的两类显微镜，它通过改变照明系统，在样品表面投射条纹，通过调制样品的空间频率来采集包含样品细节的高频信息，再通过后期算法还原，来实现超分辨率成像。结构光照明显微镜有着无需高荧光标记密度和特异荧光染料成像速度快，入射光功率低不易漂白，成像速度快可实时观测等优点，但是其分辨率相对受限。受激发射损耗显微术是通过高功率的损耗光使部分被激发的荧光分子受激辐射而猝灭，从而降低自发辐射的荧光点扩散函数的宽度，来实现超分辨率显微成像的技术。虽然技术使用的高功率的损耗光较容易对样品造成漂白，但是相比单分子定位技术，它在成像速度上有着显著的优势，分辨率相交结构光照明显微镜又有较大的提升。但是受激发射损耗显微镜的高速成像依赖于标记密集的标本、相对较低的空间分辨率和相当小的视野。所以快速点扫描通常需要高重复率激光器，这会增强样品的光漂白和光损伤。所以科学家们在这基础上引入了并行受激发射损耗显微镜，可以在同样的扫描域和分辨率下以倍数降低扫描时间，进而实现大视野下低光损伤的快速扫描。然而这种情况只适用于二维扫描，只能获取样品的横向分布信息，而无法得到准确的轴向结构信息，通过层切实现的三维结构光显微镜又无法实现快速成像，这限制了其在生命科学领域的应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于并行受激发射损耗显微镜和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置，可实现三维超分辨显微成像。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种基于并行受激发射损耗显微镜和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，包括以下步骤：1)照明光激光器以宽场光对样品进行照明激发；2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后投射在样品表面；3)通过显微物镜收集样品受激发出的荧光信号，用分束镜分为两路光线，第一路光完整投射在工业相机上，第二路光经过放置在物镜等效后焦面上的光阑再投射在另一个工业相机上；4)移动并行损耗光图样对照明范围内的样品进行扫描，对两路工业相机采集到的多幅图像分别进行对应的针孔滤波；对第一路光采集到的图像结果进行反卷积后叠加，即为样品的二维超分辨图像结果；5)对步骤4)中针孔滤波后的两组图像，其中第一路光的图像包括样品的超临界角荧光分量和亚临界角荧光分量，第二路光的图像仅包括样品的亚临界角荧光分量；根据这两组图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个针孔中心点的轴向位置信息；6)将还原的轴向位置信息与步骤4)获得的二维超分辨图像相结合，得到样品的三维分布信息。进一步地，照明光激光器使用波长638纳米的激光，损耗光激光器使用波长775纳米的激光。进一步地，步骤3)中光阑的大小满足ρ＝nofsinθc，其中no是显微物镜浸入介质的折射率，f是物镜的焦距，θc＝arcsin(nm/ng)，其中nm为样品介质的折射率，ng为玻璃界面的折射率。进一步地，对于离平面较远的荧光分子的探测光，其中只包含亚临界角荧光成分而不包含超临界角荧光成分，由一个放置在物镜等效后焦面上的CCD获取亚临界角荧光的角分布直径大小，再根据角分布直径大小设计光阑直径大小，再把CCD替换成光阑，将光阑放入光路中，调整光阑位置使得光阑与光路共轴。进一步地，步骤5)中，根据针孔滤波后的图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，具体为：对步骤4)中每一张图像，图像上每一个针孔对应的范围内的所有点的平均值即为这个针孔中心点的测量值，对第一路光图像和第二路光图像的测量值分别叠加成完整图像，用第一路光的测量结果与第二路光的测量结果做差分，得到样品荧光的超临界角荧光分量，再用该差分结果除以第二路光的测量结果，得到归一化后的超临界角荧光比值分布，其随样品分子离开分界面的轴向距离成指数递减。为了实现上述方法，本专利技术提供的成像装置包括：横向超分辨模块即并行受激发射损耗显微镜：包括用于产生激发光的照明光激光器；用于产生损耗光的损耗光激光器；用于传输激光的单模光纤；用于反射和准直的透镜组；用于产生并行损耗光图样的并行受激发射损耗显微损耗模块，该模块为核心部分。轴向超分辨模块：包括用于收集样品发出的荧光信号的显微物镜；用于透射照明光，反射荧光信号的二向色镜；用于获取轴向位置信息的超临界角荧光探测模块，该模块为核心部分，包括用于获取物镜等效后焦面的4f透镜组，用于分束的半透半反镜，用于限制光束的光阑(仅第二路光路中使用)，用于滤去杂散光的滤波片，用于将样品荧光信号成像的透镜，用于接收样品荧光信号的工业相机。进一步地，关于横向超分辨模块中的并行受激发射损耗显微损耗模块，目的是产生阵列的甜甜圈形损耗图案，只要能实现该功能的器件均可使用。常用的方法是将损耗光分束加不同偏振再分束，产生两组方向垂直的干涉条纹，叠加后刚好能形成所需的损耗空洞。进一步地，为了提升并行受激发射损耗显微镜的成像速度，区别于其他并行受激发射损耗显微镜中运用压电致动器直接移动条纹对样品面进行扫描，本专利技术中使用电光调制器来移相，通过改变施加在电光调制器上的电压改变相干光的相位，进而使干涉条纹发生移动，阵列损耗空洞随之发生移动。电光调制器相较压电致动器一方面更加便宜，减少了设备总成本，另一方面移动速率也更高，使得采集速率仅受限于相机的刷新速率。由于并行受激发射损耗显微镜取消了传统受激发射损耗显微镜中的滤波针孔，所以对于每一组损耗空洞所获得的图像，需要在对应损耗空洞的位置进行针孔滤波后，再对图像组进行叠加，这样有利于降低图像的噪声。进一步地，显微物镜为了能最大限度的收集样品发出的全部荧光信号，宜采用较大数值孔径，数值孔径NA需大于等于1.49。进一步地，关于轴向位置计算的方法，主要是通过单个染料分子超临界角荧光(SAF)强度沿轴变化的关系来还原每个像素点上荧光的空间位置。单个染料分子受激所发出的荧光包含亚临界角荧光(UAF)部分和超临界角荧光(SAF)部分。单个染料分子所发出的亚临界角荧光(U本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)照明光激光器以宽场光对样品进行照明激发。/n2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后投射在样品表面。/n3)通过显微物镜收集样品受激发出的荧光信号，用分束镜分为两路光线，第一路光完整投射在工业相机上，第二路光经过放置在物镜等效后焦面上的光阑再投射在另一个工业相机上。/n4)移动并行损耗光图样对照明范围内的样品进行扫描，对两路工业相机采集到的多幅图像分别进行对应的针孔滤波；对第一路光采集到的图像结果进行反卷积后叠加，即为样品的二维超分辨图像结果。/n5)对步骤4)中针孔滤波后的两组图像，其中第一路光的图像包括样品的超临界角荧光分量和亚临界角荧光分量，第二路光的图像仅包括样品的亚临界角荧光分量；根据这两组图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个针孔中心点的轴向位置信息。/n6)将还原的轴向位置信息与步骤4)获得的二维超分辨图像相结合，得到样品的三维分布信息。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)照明光激光器以宽场光对样品进行照明激发。
2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后投射在样品表面。
3)通过显微物镜收集样品受激发出的荧光信号，用分束镜分为两路光线，第一路光完整投射在工业相机上，第二路光经过放置在物镜等效后焦面上的光阑再投射在另一个工业相机上。
4)移动并行损耗光图样对照明范围内的样品进行扫描，对两路工业相机采集到的多幅图像分别进行对应的针孔滤波；对第一路光采集到的图像结果进行反卷积后叠加，即为样品的二维超分辨图像结果。
5)对步骤4)中针孔滤波后的两组图像，其中第一路光的图像包括样品的超临界角荧光分量和亚临界角荧光分量，第二路光的图像仅包括样品的亚临界角荧光分量；根据这两组图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个针孔中心点的轴向位置信息。
6)将还原的轴向位置信息与步骤4)获得的二维超分辨图像相结合，得到样品的三维分布信息。


2.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述照明光激光器使用波长638纳米的激光，损耗光激光器使用波长775纳米的激光。


3.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤3)中光阑的大小满足ρ＝nofsinθc，其中no是显微物镜浸入介质的折射率，f是物镜的焦距，θc＝arcsin(nm/ng)，其中nm为样品介质的折射率，ng为玻璃界面的折射率。


4.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，对于离平面较远的荧光分子的探测光，其中只包含亚临界角荧光成分而不包含超临界角荧光成分，由一个放置在物镜等效后焦面上的CCD获取亚临界角荧光的角分布直径大小，再根据角分布直径大小设计光阑直径大小，再把CCD替换成光阑，将光阑放入光路中，调整光阑位置使得光阑与光路共轴。

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【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，王玥颖，袁逸凡，刘文杰，刘旭，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33