一种使用高光谱鉴定玉米抗旱基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用高光谱表型性状来鉴定玉米抗旱基因的方法，包括：干旱胁迫条件与正常条件下玉米植株生长状况的图像采集与图像处理，获取高光谱表型性状；高光谱表型性状降维处理；高光谱表型性状的遗传力分析；高光谱表型性状的全基因组关联分析，筛选抗旱相关的候选基因；高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证。在现有的技术中，玉米抗旱相关的生理生化指标测定方法多为有损测量，抗旱基因鉴定多采用基因克隆和转基因技术等生物技术。该方法基于图像信息，可实现玉米植株水平上相关指标的无损与精确测量，除此之外，该方法结合光谱技术与图像处理技术，验证这些技术在玉米抗旱基因鉴定方面的可行性，可为玉米抗旱基因鉴定工作提供新思路与新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种使用高光谱鉴定玉米抗旱基因的方法
本专利技术属于作物信息领域，涉及使用高光谱表型性状来鉴定玉米抗旱基因的方法。
技术介绍
玉米是世界上主要的农作物之一，是重要的饲料作物和生物能源。玉米是需水量较大的作物，随着生态环境不断破坏、我国干旱频繁发生，干旱胁迫已然成为限制玉米生长发育和产量最重要的非生物胁迫之一，因此，玉米的抗旱育种研究意义重大。随着基因组学与生物技术的发展，我国玉米抗旱基因鉴定工作取得了重大进展。BADH基因在花生、水稻、小麦等植物上成功克隆并表达，得到抗旱与耐盐较强的植株，郑成忠等(2016)将外源BADH基因以单拷贝形式整合到玉米基因组中，对T6代阳性植株进行干旱与盐胁迫处理后，测定脯氨酸、POD活性等生理生化指标，结果表明其抗旱耐盐性显著增强。祁茂冬(2018)利用生物信息学方法鉴定出41个玉米HSP70家族成员，通过对基因启动子区逆境和激素相关元件分析筛选出响应干旱胁迫的候选基因，构建相关基因超表达载体并转化拟南芥进行干旱响应验证，结果表明ZmHSP70-1、ZmHSP70-8在玉米响应干旱逆境过程中发挥着正调节因子作用。MAPK级联途径参与了植物干旱信号传递以及抗旱响应，赵冰兵(2019)以玉米MAPK家族中的ZmMKKK18基因为潜在的耐旱基因，构建ZmMKKK18基因的过表达载体，利用农杆菌介导转化玉米材料ZPM9，进行梯度干旱胁迫处理，鉴定抗旱相关指标，发现在干旱胁迫条件下ZmMKKK18基因提高了植株耐旱性。相关研究表明过表达MIPS可增强植物对高盐、冷和氧化等环境的耐受性，郝广龙(2019)在玉米中共克隆到2个ZmMIPS基因，将其过表达提高了拟南芥叶片中的肌醇含量和拟南芥的抗旱性。崔扬等(2019)通过RT-PCR的方法从耐旱玉米自选系X923-1根部总RNA中克隆了zmIDP2557基因，构建该基因由组成型启动子35S驱动植物表达载体，并通过农杆菌介导法获得该基因过表达的转基因玉米植株，通过对T1代转基因玉米进行抗旱性鉴定证实过表达该基因可显著提高转基因玉米的抗旱能力。综上，当前玉米抗旱基因鉴定多基于基因克隆与转基因技术，同时结合了遗传转化等生物技术，这些技术已成熟，但在测定抗旱相关的生理生化指标时仍采用的是有损测量的方法。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了克服现有玉米抗旱基因鉴定时测定抗旱相关的生理生化指标方法中有损测量这一问题，本专利技术提供了一种使用高光谱表型性状来鉴定玉米抗旱基因的方法，结合图像处理技术实现抗旱相关指标的无损、精确测量，鉴定玉米抗旱基因。(二)技术方案本专利技术为了解决其技术问题所采用的技术方案，提供了一种使用高光谱表型性状来鉴定玉米抗旱基因的方法，该方法的总体技术流程见图1。一种使用高光谱鉴定玉米抗旱基因的方法，本方法创造性的将高通量高光谱检测技术和全基因组关联分析技术结合，突破传统方法有损、低效、测量参数有限的缺点，提出一种玉米抗旱功能基因挖掘新方法，具体包括如下步骤：步骤A，不同自交系组成的盆栽玉米群体在干旱胁迫条件与正常条件下多重复生长状况的高光谱实现高通量数据采集，并对高光谱二进制数据流进行重整得到各波段下的高光谱图像，接着进行图像分割、图像掩摸和数据分析，进而获取海量高光谱表型性状；步骤B，高光谱表型性状降维处理和关键性状筛选，包括异常值筛选、重复性检验、独立样本T检验、主成分分析、多层感知器筛选与遗传力分析，进而筛选出遗传力高且玉米抗旱高度相关的高光谱表型性状；步骤C，利用混合线性模型对筛选后的高光谱表型性状进行全基因组关联分析，结合玉米基因组注释，查找显著关联SNP邻近基因以及热点基因作为玉米抗旱功能的候选基因；步骤D，高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在正常浇水和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。更具体地，所述步骤A中的数据采集系统采用作物表型全自动高通量检测平台中的高光谱成像系统，数据采集的内容为不同品种的盆栽玉米在两个不同年份间的干旱胁迫条件与正常条件下干旱胁迫前、干旱胁迫期与复水期三个阶段的不同时间点生长状况的高光谱数据流，包括顶视高光谱数据与侧视高光谱数据，由此获得最终的高光谱数据流。更具体地，所述步骤A中的图像处理和数据分析采用LabVIEW8.6，将获得的二进制数据流重整为各波段下的高光谱图像；取其中两个波段下高光谱图像相除，获得玉米区域较为突出的灰度图；采用OTSU法对此灰度图像进行分割，获得二值图像；OTSU的计算方法如下：：假设一幅图像的像素总数为N，灰度级总数为L，其中灰度级为i的像素个数为Ni，0≤i≤L-1，其中∑Ni＝N；记t为前景和背景的分割阈值，前景点像素个数占图像的比例为b0，平均灰度值为g0；背景点像素个数占图像的比例为b1，平均灰度值为g1，这些参数之间的关系如下：b1＝1-b0那么，图像的总平均灰度值为：g＝b0×g0+b1×g1前景和背景部分的方差为：s＝b0×(g0-g)2+b1×(g1-g)2当方差s最大时，认为此时的前景和背景的差别最大，当前t即为OTSU的阈值。更具体地，所述步骤A中获取高光谱表型性状，其特征在于：基于OTSU法分割获得的二值图像对高光谱全波段图像进行掩膜，得到全波段的感兴趣区域图像，利用所有波段下的掩摸图像信息进行计算和提取光谱指数；提取出海量的光谱指数，接下来通过降维处理选择合适的光谱指数，包含以下几个方面：首先使用3σ标准去除异常值；接着计算不同重复以及不同年份之间的数据的重复性，剔除重复性差的高光谱表型；然后使用独立样本t检验剔除干旱胁迫组与正常条件下差异不显著的高光谱表型，其置信区间设置为95％；接下来进行主成分分析；最后采用多层感知器MLP选择出重要的高光谱表型性状，为了减少随机误差，重复五次MLP，将最终平均重要性超过50％的高光谱性状留下来进行后续分析。更具体地，所述步骤B中高光谱表型性状的遗传力分析使用方差分析的方法进行；对不同实验时期的可再现性W2计算如下：其中，Vg、Ve和n分别表示基因型方差、重复测量产生的差异和每一品种的重复测量植株数。更具体的，所述步骤C中的高光谱表型性状的全基因组关联分析，其特征在于：利用获得的高光谱表型数据，结合玉米关联群体材料高质量SNP标记，利用混合线性模型进行基因型和表型的关联；使用TASSEL5.0软件中不压缩的P3D方法进行全基因组关联分析。更具体地，所述步骤D中的高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，其特征在于：对获得的候选基因进行简单的功能注释，结合候选基因在正常浇水和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，以及与其他抗旱表型的候选基因关联分析结果，参考这些结果，挑选一些没有报道抗旱功能的候选基因，进行抗旱性分析；利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用高光谱鉴定玉米抗旱基因的方法，其特征在于将高通量高光谱检测技术和全基因组关联分析技术结合，突破传统方法有损、低效、测量参数有限的缺点，提出一种玉米抗旱功能基因挖掘新方法，具体包括如下步骤：/n步骤A，不同自交系组成的盆栽玉米群体在干旱胁迫条件与正常条件下多重复生长状况的高光谱实现高通量数据采集，并对高光谱二进制数据流进行重整得到各波段下的高光谱图像，接着进行图像分割、图像掩摸和数据分析，进而获取海量高光谱表型性状；/n步骤B，高光谱表型性状降维处理和关键性状筛选，包括异常值筛选、重复性检验、独立样本T检验、主成分分析、多层感知器筛选与遗传力分析，进而筛选出遗传力高且玉米抗旱高度相关的高光谱表型性状；/n步骤C，利用混合线性模型对筛选后的高光谱表型性状进行全基因组关联分析，结合玉米基因组注释，查找显著关联SNP邻近基因以及热点基因作为玉米抗旱功能的候选基因；/n步骤D，高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在正常浇水和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。/n

【技术特征摘要】
1.一种使用高光谱鉴定玉米抗旱基因的方法，其特征在于将高通量高光谱检测技术和全基因组关联分析技术结合，突破传统方法有损、低效、测量参数有限的缺点，提出一种玉米抗旱功能基因挖掘新方法，具体包括如下步骤：
步骤A，不同自交系组成的盆栽玉米群体在干旱胁迫条件与正常条件下多重复生长状况的高光谱实现高通量数据采集，并对高光谱二进制数据流进行重整得到各波段下的高光谱图像，接着进行图像分割、图像掩摸和数据分析，进而获取海量高光谱表型性状；
步骤B，高光谱表型性状降维处理和关键性状筛选，包括异常值筛选、重复性检验、独立样本T检验、主成分分析、多层感知器筛选与遗传力分析，进而筛选出遗传力高且玉米抗旱高度相关的高光谱表型性状；
步骤C，利用混合线性模型对筛选后的高光谱表型性状进行全基因组关联分析，结合玉米基因组注释，查找显著关联SNP邻近基因以及热点基因作为玉米抗旱功能的候选基因；
步骤D，高光谱表型性状关联的候选基因抗旱功能验证，结合候选基因在正常浇水和干旱胁迫下表达量数据进行eQTL分析，利用候选基因的突变体或转基因材料，进行抗旱表型性状的考查，确认候选基因的抗旱功能。


2.根据权利要求书1所述的方法，所述步骤A中的数据采集系统采用作物表型全自动高通量检测平台中的高光谱成像系统，数据采集的内容为不同品种的盆栽玉米在两个不同年份间的干旱胁迫条件与正常条件下干旱胁迫前、干旱胁迫期与复水期三个阶段的不同时间点生长状况的高光谱数据流，包括顶视高光谱数据与侧视高光谱数据，由此获得最终的高光谱数据流。


3.根据权利要求书1所述的方法，所述步骤A中的图像处理和数据分析采用LabVIEW8.6，将获得的二进制数据流重整为各波段下的高光谱图像；取其中两个波段下高光谱图像相除，获得玉米区域较为突出的灰度图；采用OTSU法对此灰度图像进行分割，获得二值图像；OTSU的计算方法如下：
假设一幅图像的像素总数为N，灰度级总数为L，其中灰度级为i的像素个数为Ni，0≤i≤L-1，其中∑Ni＝N；记t为前景和背景的分割阈值，前景点像素个数占图像的比例为b0，平均灰度值为g0；背景点像素个数占图像的比例为b1，平均灰度值为g1，这些参数之间的关系如下：






b1＝1-b0



那么，图像的总平...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨万能，冯慧，代明球，伍玺，叶军立，戴国新，李为坤，耿泽栋，宋京燕，陈国兴，熊立仲，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42