DNA-固定化基质的重新利用方法技术

本发明专利技术提供ＤＮＡ－固定化基质的再使用方法，由此使得昂贵的ＤＮＡ－固定化基质可有效被利用，且提供可再使用的ＤＮＡ－固定化基质，该基质具有与新产品相同的性能且在实际应用中无任何问题。即，一种ＤＮＡ－固定化基质的再使用方法，其特征在于从携带由酰胺键通过寡核苷酸固定的ＤＮＡ的ＤＮＡ－固定化基质上去除ＤＮＡ而由此使得可以固定新的ＤＮＡ，在基质和ＤＮＡ之间的酰胺键用酸或碱来水解。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA-固定化基质的再使用方法。背景领域迄今，一种DNA诊断的基质已用作基因分析等的方法。DNA-固定化基质接受大量的DNA片段和寡核苷酸排列在其固相表面，且在生物化学、分子生物学和基因工程或医学检查中得到广泛的注意，这使得它可能以迅速且简化的方式来处理大量的小的样品并通过光谱学来分析反应数据。尽管这样的DNA-固定化基质极其昂贵，但再使用用过的基质以在其上再次固定任何其他DNA的方法尚未发展出来。因此，用过的基质通常被扔掉，且即使再使用，之前已经结合其上的DNA可能仍然保留在其上，且大多数用过的基质不再可实际利用。本专利技术要解决上述问题，并提供用过一次的DNA-固定化基质的再使用方法以使得有效利用昂贵的DNA-固定化基质，其中再使用的DNA-固定化基质与新基质具有相同的性能且不具有实际应用中的问题，并且本专利技术减少DNA-固定化基质使用者的经济和技术负担。专利技术公开我们本专利技术者经刻苦研究已达到上述的目标，并作为结果，发现了从已重复用于PCR扩增的DNA-固定化基质上完全去除DNA的方法和将DNA再固定在更新了的基质上的可能性。具体地，权利要求1的专利技术提供DNA-固定化基质的再使用方法，它包括从携带通过酰胺键经寡核苷酸在其上固定了DNA的DNA-固定化基质上将固定的DNA去除以此更新基质，而使得它可接受新的DNA固定其上，且其特征在于基质-DNA之间的酰胺键是用酸或碱来水解的。权利要求2的专利技术提供了DNA-固定化基质的再使用方法，它包括处理其上带有通过酰胺键固定的DNA的DNA-固定化基质，由此用酸水解基质-DNA之间的酰胺键，然后浸入碱中以去除阴离子，从而将基质表面转变为氨基基团修饰的表面。权利要求3的专利技术提供DNA-固定化基质的再使用方法，它包括处理其上带有通过酰胺键固定的DNA的DNA-固定化基质，由此用碱水解基质-DNA之间的酰胺键，从而将基质表面转变为氨基基团修饰的表面。本专利技术中用于水解的酸优选为一或多种如在权利要求4中所述的无机酸和有机酸。同样优选，用于水解的碱为如在权利要求5中所述的任何碱金属氢氧化物和/或碱金属盐。附图简述附图说明图1为迁移图，显示固定化和再固定化的证实结果。实施本专利技术的最佳方式本专利技术再使用DNA-固定化基质的方法包含从其上携带通过酰胺键经寡核苷酸固定的DNA的DNA-固定化基质上将固定的DNA去除由此更新基质，而使得它可接受新的DNA固定其上，且其特征在于基质-DNA之间的酰胺键用酸或碱来水解。在本专利技术的再使用方法中要处理的DNA-固定化基质具有经酰胺键固定在其氨基基团修饰的基质表面上的DNA。优选，该氨基基团修饰的基质通过氨化以下基质的表面而制备，如金刚石、硅、玻璃，或金属如金、银、铜、铝、钨、钼，或者覆盖于金属上的陶瓷层，或者塑料如聚碳酸酯、氟树脂(fluororesin)。除上述之外，任何其他化学稳定的材料均可用作基质，如石墨和金刚石样的碳。同样可用塑料与上述金属、陶瓷、金刚石等的混合物。同样优选用于此处的是硅、玻璃、金属、石墨、塑料和其他用金刚石或金刚石样的碳包被的材料。在那些材料中，金刚石由于其导热性而优选。金刚石具有良好的导热性并可接受快速地加热和冷却。因此，加热或冷却基质以在其上结合DNA的热循环周期可有效地缩短。具体地，基质材料的导热性可为至少0.1W/cm·K，优选至少0.5W/cm·K，更优选至少1.0W/cm·K。对于金刚石基质材料，可用任何合成的金刚石、高压塑造的金刚石、天然的金刚石等。其结构可为单晶体或多晶体的任何形式。以其生产的观点看，金刚石优选通过气相合成法生产，如通过微波等离子体辅助的CVD(microwave plasma-assisted CVD)。该基质可以任何已知的方法形成。例如，该方法包括微波等离子体辅助的CVD、ECRCVD、IPC、DC反应溅射法、ECR反应溅射法、离子电镀、电弧离子电镀、EB蒸汽沉积作用、电阻加热蒸汽沉积作用等。可将金属粉末、陶瓷粉末等与树脂粘合剂混合，并可塑造为基质以用于此处。除此之外，可将金属粉末、陶瓷粉末等起始材料通过用压力机挤压成未淬火的压块(green compact)，且该压块可在高温进行烧结。优选，基质的表面故意制成粗糙样。粗糙的表面由于其表面积增加而有利于固定大量的DNA等。基质的形状没有特定限定，且可为扁平的、线状的、球形的、多角形的、粉状的等。此外，基质的大小也没有特定地限定。在本专利技术中所用的金刚石基质可包括包含金刚石和任何其他物质的复合材料(如金刚石或金刚石样的碳的两相复合材料)。基质表面的氨基基团修饰可通过如在氯气中用UV射线照射该固体基质而氯化基质表面并随后在氨气中用UV射线进一步地照射以氨化而获得。氨基基团修饰的基质表面可通过用适当的酸性氯化物羧化并随后将末端羧基基团与碳二亚胺或二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺脱水和缩合而用羧酸来修饰。描述了根据本方法的脱水缩合的一个实例。将其表面已被修饰而具有羧基基团的固体基质浸入到1，4-二氧六烷溶液中，在其中溶解有碳二亚胺或二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺或对硝基酚，然后洗涤并干燥。这样处理后，该基质即在其末端具有结合了N-琥珀酰亚胺酯基或对硝基酚酯的烃基基团。上述方法中更优选，预先在金刚石基质上形成了伯氨基基团，且这是用活化的二酯处理而使得该二酯的一个酯基通过脱水缩合结合到该伯氨基基团上。该活化的二酯具有上文所述的两个活化的酯基。优选，该酯基位于该活化二酯的两个末端，且各具有0～12，更优选0～6个碳原子。同样优选，除酯基之外的主链部分为线性饱和脂肪酸。在使用这样的活化酯的方法中，可以用与上述相同的方式将基质氯化然后氨化，其后其中的氨基基团可与一个活化酯反应以获得预期的基质，该活化酯预先通过用琥珀酸(二羧酸)对N-羟基琥珀酰亚胺的活化酯化反应而制备。因而，具有羧酸修饰的表面并具有经寡核苷酸固定于其表面的DNA的基质将根据本专利技术来处理以供再次使用。将要固定于基质上的DNA没有特定的限定，且可为任何单链的cDNA(互补DNA)或双链的gDNA(基因组DNA、染色体DNA)。DNA的链长度没有特定的限定。该寡核苷酸应该依赖于要结合到基质上的DNA的类型而适当地选择。在单链cDNA固定到基质上的情况下，可利用以mRNA为模板的反转录，且可将作为反转录引物的寡脱氧胸苷酸等用作寡核苷酸。另一方面，双链gDNA的固定可通过使用限制性内切酶切割位点来实施。在这种情况下，所用的寡核苷酸应该在DNA结合一侧具有限制性内切酶切割位点。在本专利技术中，将用过的无用的DNA-固定化基质浸入酸或碱溶液中，由此基质-DNA之间的酰胺键被水解和切割，然后其表面由此更新为具有氨基基团修饰的表面。用于水解的酸优选为无机酸如盐酸，但可为任何其他的能够水解酰胺键的无机酸或有机酸。在碱用于水解的情况下，优选碱金属氢氧化物，但可为任何其他的碱性盐如碱金属碳酸盐。描述了水解的条件。对于酸水解，将DNA-固定化的基质置于6M盐酸中并在80～100℃反应几个小时至24小时以由此完全水解基质-DNA之间的酰胺键。对于碱水解，将DNA-固定化的基质置于2M NaOH中并在室温反应几个小时至24小时以借此水解基质-DNA之间的酰胺键。在酸水解后，基质表面上有阴本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＤＮＡ－固定化基质的再使用方法，它包括从其上携带有通过酰胺键经寡核苷酸固定的ＤＮＡ的ＤＮＡ－固定化基质上将固定的ＤＮＡ去除而由此更新基质，以使得它可接受新的ＤＮＡ固定于其上，且其特征在于基质－ＤＮＡ之间的酰胺键用酸或碱来水解。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高桥浩二郎，高井修，丹花通文，
申请(专利权)人：东洋钢钣株式会社，高桥浩二郎，日本帕克里津广岛株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]