基于质谱技术的阳性血培养液病原微生物的快速分离试剂、分离方法及微生物鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种用于阳性血培养样本中选择性裂解和细菌分离的试剂，利用所述试剂可以从阳性血培养样本中快速分离细菌，同时其对于患有慢性疾病病人的阳性血液也具有很好的细菌分离效果，所述试剂包括用于溶解血液中血细胞的裂解液A以及用作清洗剂的清洗液I和清洗液II，所述试剂A为皂素溶液，所述清洗液I为尿素溶液。除此之外，本发明专利技术还提供一种从阳性血培养样本中分离细菌的方法及细菌鉴定方法，按照所述方法采用上述试剂进行试验，可实现从阳性血培养样本中快速分离细菌，同时最大程度地清除对鉴定结果可能产生干扰的血细胞碎片以及蛋白杂质，极大地提高了检测的准确率。

【技术实现步骤摘要】
基于质谱技术的阳性血培养液病原微生物的快速分离试剂、分离方法及微生物鉴定方法
本专利技术属于血液中细菌分离及鉴定领域，具体地，本专利技术提供从阳性血中分离细菌的试剂和方法及细菌鉴定方法。
技术介绍
血流感染是败血症与菌血症的统称，败血症(septicemia)是由各种病原微生物(细菌或真菌)和毒素侵入血流所引起的血液感染，主要临床表现为：骤发寒战，高热，心跳过速，呼吸急促，皮疹，肝脾肿大和精神、神志改变等一系列严重临床症状，严重者可引起休克、弥散性血管内凝血(DIC)和多脏器功能衰竭。若细菌仅短暂入血，而无临床明显的毒血症状(如血管相关性感染)则称为菌血症(bacteremia)。近年来，随着创伤性诊疗技术的广泛开展以及广谱抗生素、激素的广泛应用，血流感染的发病率有逐年增高趋势。血流感染病死率高，且延长住院时间，增加住院费用，危害严重。因此，血流感染的控制越来越受到人们的关注。目前，血培养是诊断血流感染的金标准，它是一种将新鲜离体的血液标本接种于营养培养基上，在一定温度、湿度等条件下，使对营养要求较高的细菌生长繁殖并对其进行鉴别，从而确定病原菌的一种人工培养法。通常用于菌血症、真菌血症、败血症及脓毒败血症的病因学诊断。而对于血流感染，通常采用自动化血培养仪器进行增菌培养直至报阳，这个过程通常需要24-96h，在报阳后，工作人员需将报阳后的血培养液转种到合适的平板培养基上，直至长出菌落，这个过程通常又需要消耗5-24h，之后才能进行药敏与鉴定的流程。目前，现有的微生物诊断检测方法通常需要8h以上，然而，对于血流感染患者来说，生命随时处于危险之中，因此血培养报阳后对病原菌体的快速检测对于临床的重要性不言而喻。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)近年来被广泛应用于临床微生物的检测，它通过检测分子量在2000-20000区间的蛋白离子来确定微生物的种属。不同种的微生物均会表达基于自身遗传物质的确定的蛋白组，而不同的蛋白具有各自特定的分子量，因此通过质谱来检测这些特定的蛋白质的分子量便可以对微生物进行种属分类。基于质谱技术的微生物鉴定方法十分依赖于其自身的数据库建设水平，只有待测微生物匹配上收录到数据库中的微生物的蛋白谱，该菌才可以被检测出，虽然受限于数据库，但是质谱技术相较于常规细菌鉴定方法仍然具有速度更快、准确率更高、成本更低等远远领先的优势。如果能够结合质谱技术对血流感染中的病原微生物进行快速检测，则能够节省转种与常规鉴定所消耗的时间，这无疑是血流感染患者的福音，公布号为CN102471798A的中国专利技术专利申请文件提出了一种败血症的质谱诊断方案，在该方案提供了一种对阳性血培养液无需转种传代，即可通过MALDI-TOF-MS技术对样本进快速检测的方法，这种方法采用了表面活性剂-SDS(十二烷基磺酸钠)，来裂解样本中的红细胞于白细胞，之后通过离心收集得到待测物，然后通过质谱进行检测，但是当检测样本为患有慢性病(例如高血糖、高血脂等)患者的阳性血培养液时，由于患者体内白细胞数量升高，而SDS是一种强阴离子表面活性剂，会导致细胞的核膜破裂，从而释放出白细胞核内的DNA分子，DNA是一种粘性多糖类物质，在提取液中会表现出类鼻涕状粘性物质，造成40％的血液样本形成大的粘性块并可视地充溢在深红色液体中。虽然本领域技术人员可以用移液管吸取粘性物周围的一些液体用于进一步处理，但是该方法非常困难，并且会因未知因素降低检测极限，只有通过稀释血液样本或者添加抗凝剂等技术手段才能避免粘性物质的产生，但与此同时又带来了检测准确率以及灵敏度降低的问题。
技术实现思路
为克服以上现有技术中检测患有慢性疾病或者未知疾病患者血液中细菌鉴定准确率无法保证的问题，本专利技术提供从患有慢性病(例如高血脂、高血糖等)患者报阳血(含有细菌的血液)中分离细菌的试剂和血液中分离细菌的方法及细菌鉴定方法，细菌鉴定准确率显著提高。本专利技术的检测原理是：利用基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术，用于微生物样品鉴定与分类。首先待测样本经本试剂盒进行细菌分离后，利用甲酸乙腈促进细胞中的蛋白完整释放出来，取1μL提取液均匀涂布于靶板上，加1μL基质，自然晾干后放入质谱仪器。带点的蛋白质离子依质荷比不同而被分离，最终检测得到完整的蛋白图谱，从而进行血液中微生物的快速鉴定。第一方面，本专利技术提供从阳性血中分离细菌的试剂，其组分包括：用于溶解血细胞的裂解液A，和用作清洗剂的清洗液I。其中，所述裂解液A为皂素溶液，所述清洗液为尿素溶液。优选地，所述裂解液A的浓度为0.5-1.5g/mL。优选地，所述清洗液I的浓度为4-7mol/L。优选地，所述试剂还包括清洗液II，所述清洗液为超纯水、蒸馏水或去离子水等。第二方面，本专利技术提供一种采用上述试剂从阳性血中分离细菌的方法，包括以下步骤：(1)从阳性血培养瓶抽取血液样本添加到离心管中，加入裂解液A，混合均匀，室温静置；(2)振荡混匀，400-600g(离心力)离心，弃上清；(3)向沉淀中加入清洗液I，洗涤后，11000-13000g离心，弃上清；(4)向沉淀中加入清洗液II，洗涤后，11000-13000g离心，弃上清，沉淀为细菌菌体。优选地，所述待测样本与裂解液A的总体积的体积比在5：1到5：2之间。优选地，所述待测样本与清洗液I、清洗液II的体积比在3：1到2：1之间。第三方面，本专利技术提供一种采用上述试剂进行血液中细菌鉴定的方法，包括以下步骤(1)按照上述细菌分离方法，制备用于质谱鉴定的样品；(2)取上述细菌分离样品，加入促进细胞中蛋白释放的甲酸以及乙腈；(3)振荡混匀，11000-13000g离心；(4)取1μL上清液点样到靶板的孔位上，室温干燥；(5)覆盖1-2μL的基质于样品上，室温干燥；(6)采用飞行时间质谱仪进行检测，获得质谱图。优选地，所述甲酸的浓度为60％-80％，所述乙腈的浓度为80％-100％。优选地，所述待测样本与甲酸、乙腈的总体积的体积比在50：1到50：3之间。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益优点：(1)本专利技术采用皂素溶液作为裂解液A，用于溶解血液中的白细胞、红细胞和血小板，替代了常规的表面活性剂，在检测样本为患有慢性病(例如高血脂及高血糖等)的阳性血液样本时，避免了粘性物质的出现，同时皂素作为一种天然的非离子型表面活性剂降低了阴离子表面活性剂对质谱电离过程的抑制效应，提高了质谱鉴定的准确率。(2)本专利技术设计了两步清洗，第一步用尿素溶液清洗，第二步使用超纯水清洗，这保证了与检测无关的杂质离子被清洗的更彻底，使得试剂的检测准确度大大提高。附图说明图1为裂解液A采用不同表面活性剂及清洗剂的组合阴沟肠杆菌质谱检测图图2为裂解液A采用不同皂素浓度阴沟肠杆菌质谱检测图后的SPC活性检测图。具体实施方式下面结合附图及具体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阳性血培养液病原微生物的分离试剂，包括用于溶解血细胞的裂解液A、用作清洗剂的清洗液I，其特征在于，所述裂解液A为皂素溶液，所述清洗液I为尿素溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种阳性血培养液病原微生物的分离试剂，包括用于溶解血细胞的裂解液A、用作清洗剂的清洗液I，其特征在于，所述裂解液A为皂素溶液，所述清洗液I为尿素溶液。


2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述裂解液A的浓度为0.5g/mL-2g/mL。


3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述清洗液I的浓度为4mol/L-7mol/L。


4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括清洗液II，所述清洗液II为超纯水、去离子水或蒸馏水。


5.一种采用如权利要求1-4中任一项所述的试剂从阳性血培养液中分离细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将阳性血培养液加入裂解液A，混合均匀，室温静置；
(2)振荡混匀，400-600g离心，弃上清；
(3)向沉淀中加入清洗液I，洗涤后，11000-13000g离心，弃上清；
(4)向沉淀中加入清洗液II，洗涤后，11000-13000g离心，弃上清，沉淀为细菌菌体。

【专利技术属性】
技术研发人员：包克非，宋海平，靖广旭，李桃，高雪洁，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50