一种光循环放大型生物芯片检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种光循环放大型生物芯片检测的方法。该方法将酶循环和生物发光结合起来，通过ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＃＋［＋］氧化还原对在电极上的循环实现ＦＭＮＨ＃－［２］的积累，高度积累的ＦＭＮＨ＃－［２］与其他发光底物荧光素酶、长链的醛及氧气反应发出波长４９０ｎｍ的荧光，这种光维持时间长，光密度大。本发明专利技术不仅灵敏度高、成本低廉而且操作简单、适用于各类生物样品的分析，在高密度生物芯片及蛋白质芯片的开发方面有极好前景。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物分析技术，更具体涉及，适用于生物芯片上各类生物样品的分析。
技术介绍
目前，生物芯片的检测方法主要是基于放射性同位素和光学检测，但由于同位素的污染和危害，人们在尽量避免对它的使用，所以荧光和化学发光成了生物芯片的主要检测手段。然而由于待测生物样品的极低浓度限制了标记物的浓度，所以只能检测到极为微弱的光学信号，这就要求必须使用非常灵敏的检测装置，例如冷光偶合器件(cooled CCD)，去捕捉这种信号，这些装置的价格目前还很高，显然这就造成了检测成本的昂贵。在高密度的生物芯片中，反应室空间极为狭小，所能加入的反应底物极为少量，这同样限制了检测手段的灵敏度，所以常用的检测手段难以在高密度芯片发展使用。在DNA芯片中可以通过PCR方法来扩增核酸的浓度，然而蛋白质目前还不能象核酸那样进行浓度的扩增，这是开发蛋白质芯片的一个关键性障碍。关于生物发光，目前多指萤火虫和海生细菌所发的波长为490nm的冷光。发光对这些生物来说可能是一种趋利避害的策略，比如除去有害的O2或者逃避天敌的捕猎。发光反应的底物主要涉及有荧光素，荧光素酶和O2等。虽然人类对生物发光已经研究的较为透彻，但迄今为止，人类对生物发光的应用还仅仅局限于两个方面一是卫生监测，例如通过对ATP或NADH的定量测定细菌数是否超标，目前对ATP或NADH检测的线性范围可达10-12-10-6M；二是将发光基因lux作为报告基因应用于基因表达分析和免疫分析。将生物发光这种生物体内的精巧机制应用于生物芯片尚无报道和应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供，将电化学和生物发光结合起来，通过电化学循环积累目标产物，将灵敏度提高一至二个数量级，降低了检测成本，主要应用于蛋白质芯片及高密度生物芯片。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案涉及到的反应底物有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)与黄素单核苷酸(FMN)的特异性氧化还原酶(NADH-FMN Oxidereductase)、黄素单核苷酸(FMN)、还原型黄素单核苷酸(FMNH2)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、、氧气(O2)、七个碳原子以上的醛(R-CHO)、海洋细菌荧光素酶(Luciferase)以及电子介体二茂铁等。其步骤如下1、将待检测的生物样品(受体)固定于芯片的反应室，如抗体，固定于芯片的反应室。2、将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)与黄素单核苷酸(FMN)的特异性氧化还原酶(NADH-FMNOxidereductase)标记于另一种能与上述受体识别并结合的生物样品，这种生物样品能与上述受体识别并结合的生物样品(配体)，如抗原。3、将步骤2中标记过酶的生物样品(配体)点样在芯片上与步骤1所固定的生物样品相应反应室内。4、将步骤1和2中的两种生物样品的反应20至50℃下温育20至50分钟。5、用一系列缓冲溶液和洗脱溶液洗脱非特异结合的生物样品然后再用去离子水洗涤。二生物样品能否相互识别并结合可以应用以下发光反应进行检测，能相互识别并结合的情况下才会有光信号出现，以此达到生物检测的目的。6、在上述芯片反应室内加入除去氧气的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素单核苷酸(FMN)以及任意一种电子介体的溶液；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素单核苷酸(FMN)在酶的催化下立刻生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)；在酶促反应的同时所生成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)在芯片电极的作用下，通过电子介体二茂铁又还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。7、上述循环进行100至10000个之后还原型黄素单核苷酸(FMNH2)大量积累，这时加入充氧的含有七个碳原子以上的醛(R-CHO)和荧光素酶(Luciferase)的反应溶液，发光反应开始并稳定持续0.01至8秒钟；反应进行的同时，用光分析仪器检测光信号。8、对信号进行分析，对待测生物样品进行定性和定量。本专利技术对于目前生物芯片常用的检测方法来说具有以下优点没有放射性危害；可以使用检测灵敏度很低的光学仪器进行检测，检测成本低廉；检测灵敏度高，比目前常用检测方法高出2至4个数量级；解决了因蛋白质不能扩增而造成的分析难题；使用试剂量少特别适用于高密度生物芯片。本专利技术的检测方法具有以下应用效果廉价的检测仪器将在生物芯片的检测上发挥重要作用，解决了目前芯片检测费用过高的难题；因为它从另一个角度解决了蛋白质芯片不能扩增的困难，所以它将大大推动蛋白质芯片的发展；这种检测方法应用试剂量少、灵敏度高、操作方便、所发出的荧光为冷光，这些优点对高密度生物芯片的发展来说无疑是巨大的动力。具体实施例方式已型肝炎抗体药物的筛选1、将通过噬菌体展示技术展示出各类可能的已型肝炎抗体的各种噬菌体分离纯化，然后用乙醛法分别固定于芯片上各个反应室内，并为各种抗体进行编号。2、用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)与黄素单核苷酸(FMN)的特异性氧化还原酶(NADH-FMNOxidereductase)标记灭活的已型肝炎病毒。3、用芯片点样仪在每个反应室内加入0.005μl的酶标记过的灭活已型肝炎病毒，并在37℃温育30分钟。4、首先用磷酸钠缓冲溶液洗涤非特异性结合的酶标灭活已型肝炎病毒和其它非特异结合物。5、在上述芯片反应室内加入除去氧气的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、黄素单核苷酸(FMN)以及电子介体二茂铁的磷酸盐溶液。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、黄素单核苷酸(FMN)在酶的催化下生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)。6、在酶促反应的同时，在芯片电极上施加-1.0v的电压，使所生成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)通过电子介体二茂铁又立刻还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。7、上述循环进行1000至10000个之后，还原型黄素单核苷酸(FMNH2)大量积累，这时加入充氧的含有壬醛和海洋细菌荧光素酶(Luciferase)的反应溶液。8、用光电倍增管检测光信号，并记录有光信号的反应室的编号。9、通过光电倍增管附带软件对信号进行分析，在对待测生物样品定性之后进一步定量。10、根据所得结果可以判断哪种噬菌体展示了已型肝炎病毒的抗体以及展示的量，并可以进一步分析这些抗体所对应的基因情况。权利要求1.，包括下列步骤A、将待检测的生物样品固定于芯片的反应室；B、将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸与黄素单核苷酸的特异性氧化还原酶标记于另一种能与上述受体识别并结合的生物样品；C、将步骤B中标记过酶的生物样品点样在芯片上与步骤A所固定的生物样品相应反应室内；D、将步骤A和步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光循环放大型生物芯片检测的方法，包括下列步骤：Ａ、将待检测的生物样品固定于芯片的反应室；Ｂ、将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸与黄素单核苷酸的特异性氧化还原酶标记于另一种能与上述受体识别并结合的生物样品 ；Ｃ、将步骤Ｂ中标记过酶的生物样品点样在芯片上与步骤Ａ所固定的生物样品相应反应室内；Ｄ、将步骤Ａ和步骤Ｂ中的两种生物样品的反应２０至５０℃下温育２０至５０分钟；Ｅ、用缓冲溶液和洗脱溶液洗脱非特异结合的生物样品然后再用去离子水洗涤 ；Ｆ、在上述芯片反应室内加入除去氧气的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黄素单核苷酸以及电子介体的溶液，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黄素单核苷酸在酶的催化下立刻生成烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和还原型黄素单核苷酸，在酶促反应的同时所生成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在芯片电极的作用下直接或通过电子介体二茂铁又还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；Ｇ 、上述循环进行１００至１００００个之后还原型黄素单核苷酸积累，这时加入充氧的含有七个碳原子以上的醛和荧光素酶的反应溶液，发光反应开始并稳定持续０．０１至８秒钟，反应进行的同时，用光分析仪器检测光信号；Ｈ、对信号进行分析，对待测生物样品进 行定性和定量。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢斌，梁振普，谢卫红，丹尼尔森本特，
申请(专利权)人：谢斌，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]