一种利用RNA恒温扩增的大肠杆菌核酸检测方法技术

本发明专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用RNA恒温扩增的大肠杆菌检测试剂盒，该检测试剂盒检测大肠杆菌的分析灵敏为0.25CFU/反应，特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。

【技术实现步骤摘要】
一种利用RNA恒温扩增的大肠杆菌核酸检测方法
本专利技术涉及环境学标本检测
，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对大肠杆菌(Escherichiacoli)进行检测的试剂盒。通过本专利技术的试剂盒可实现对船舶压载水等样品中大肠杆菌的检测，对其排放安全性进行快速、准确的评定。
技术介绍
船舶压载水装载于船舱，用于船舶航行过程的稳定。压载水中包含成千上万来自世界不同地区的水生或海洋微生物，植物和动物，通过船舶的全球航运在一个地方装载并排放到另一个地方，将其运送到全球。未经处理的压载水在船舶的目的地排放，可能会引入新的入侵海洋物种。数以百计的此类入侵已经发生，有时对当地生态系统造成毁灭性后果。国际海事组织通过了“国际船舶压载水和沉积物控制和管理公约”，该公约于2017年9月8日生效，用于处理船舶压载水，使所有船舶压载水在经过压载水处理系统处理后，达到其规定的水质指标，才能够排放到环境。该公约规定了排放压载水的两个标准，涵盖压载水交换和压载水处理。该管理规定生效后压载水的处理可以进行交换或者使用压载水系统进行处理。从生效到2019年9月8日之后的第一次换证检验将有一个过渡期，其中可以使用压载水交换。新船将要求进行压载水处理。后者通常通过安装经批准的压载水管理系统(BWMS)来满足排放标准。由于船舶的作业特点，传统的微生物检测通常采用琼脂平板培养法，操作过程繁杂且费时费力，一般需2-3天才能完成，无法适应快速检测的要求。杜邦、梅里埃、默克等国际跨国公司在微生物快速检测市场投入巨资，分别研制了如3D、和等快速检测系统，其产品应用环境多为食品检测，对于复杂的海水样品，其检测受到一定影响。根据压载水管理规定的相关指标，大肠杆菌的快速检测技术有待于进一步研发，开发出压载水使用的快速检测方法，用于我国海事部门的压载水管理和船舶执法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用RNA恒温扩增的大肠杆菌检测试剂盒，该检测试剂盒检测大肠杆菌的分析灵敏为0.25CFU/反应，特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。本专利技术的一种利用RNA恒温扩增的大肠杆菌核酸检测试剂盒，包括：(1)样本保存液：含有硫酸铵和去垢剂(2)核酸提取液：含有磁珠，捕获探针，Ec.T7引物，和内标序列捕获探针序列见序列表SEQ.ID.NO1Ec.T7引物序列见序列表SEQ.ID.NO2-4内标序列见序列表SEQ.ID.NO5(3)Ec.检测液a：含有dNTPs和NTPs等扩增所需组份，及Ec.nT7引物和内标引物，具体包含Tris10～50mM,MgCI210～40mM,dNTP0.5～5mM,NTP1～10mM,PVP401～10％,KCl5～40mM；Ec.nT7序列见序列表SEQ.ID.NO6-8；内标引物序列见序列表SEQ.ID.NO9(1)Ec.检测液b：含有dNTPs和NTPs等扩增所需组份，及用于检测靶核苷酸的单链核酸荧光探针和用于检测内标的单链核酸荧光探针，具体包含Tris10～50mM,MgCI210～40mM,dNTP0.5～5mM,NTP1～10mM,PVP401～10％,KCl5～40mM；用于检测靶核苷酸的单链核酸荧光探针序列见序列表SEQ.ID.NO10-12；用于检测内标的单链核酸荧光探针序列见序列表SEQ.ID.NO13-16(2)SAT酶液:为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mMHEPESpH7.5、10～100mMN-acetyl-Lcysteine、0.04～0.4mMzincacetate、10～100mMtrehalose、40～200mMTris-HClpH8.0、40～200mMKCl、1～10mMEDTA、2～20％v/vTritonX-100、10～40％v/vglycerol；SAT酶的稳定性直接决定了扩增反应的扩增效率和试剂盒的使用有效期。该SAT酶液中加有稳定剂，经长期稳定性试验，稳定性可达10个月，保证了试剂盒有效期达6个月。(3)Ec外标：为含104～101CFU/ml大肠杆菌的菌液(4)Ec阴性对照：为不含有大肠杆菌的溶液。附图说明图1为实施例1为本专利技术试剂盒检测海水中大肠杆菌样本的扩增图，101-104表示海水样本中的大肠杆菌浓度(CFU/ml)图2为利用本试剂盒使用过程中进行样本定量的标准曲线。X轴为样本中大肠杆菌浓度的log值，Y轴为dt值。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的描述。以下实施例仅用于更清楚的说明本专利技术的技术方案，应当指出，对于本领域在不脱离本专利技术原理前提下，还可以做出多种变形和改进，这也应该视为本专利技术的保护范围。实施例1：大肠杆菌(Ec)核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)检测试剂的研制1、捕获探针、引物和靶核酸检测探针的设计：通过对Genbank数据库已有的大肠杆菌核酸序列及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以大肠杆菌的16SrRNA的保守基因片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段设计引物及探针。2、内标检测探针的设计：依照竞争性内标探针要与检测探针GC含量相同，Tm类似的原则，设计与靶标检测探针序列完全不同，且荧光标记也不同的内标探针。3、内标的构建：根据内标探针的序列信息，通过靶标模板定点突变构建竞争性内标模板，即将靶标模板中靶标探针的结合区替换成内标探针结合的区域，其余位置序列不变。4、样本的选择：可选择海水浴场、养殖区以及港口压载水等海水5、提取体系和反应体系的建立与优化：本专利技术的提取体系和反应体系参照专利核酸恒温同步放大检测方法(SimultaneousAmplificationandTesting,SAT)(申请号:200810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)，除了捕获探针(TCO)、引物和检测探针序列、浓度及反应时间。因此本专利技术主要是对捕获探针(TCO)、引物和检测探针进行筛选，并对反应时间进行确定。样本的准备：以培养和测序鉴定为阳性的大肠杆菌做为阳性参考品；对培养至OD值约为1的大肠杆菌菌液进行梯度稀释并依次涂布平板，37℃培养12h后对平板上的菌落进行多次计数，多次计数获得大肠杆菌菌液标准品并向其中加入等体积的样本保存液保存。实验前，用样本保存液将阳性标准品进行梯度稀释至100。以样本保存液作为阴性参考品。引物、靶核酸检测探针的筛选：以上述1中设计的多组引物、靶核酸检测探针分别检测上述的阳性参考品与阴性参考品，经过反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物和靶核酸检测探针(如序列表中的SEQIDNO10-12)。内标检测探针的筛选：将上述2和3中所设计的多组内标探针及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用RNA恒温扩增的大肠杆菌(Escherichia coli)核酸检测试剂盒，试剂盒包括：a./n分别装有样本保存液、核酸提取液、Ec.检测液a、Ec.检测液b、SAT酶液、洗涤液、Ec.阳性标准品、Ec.阴性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和b.分隔并集中包装这些试剂瓶或者管的包装盒。/n(1)样本保存液：含有硫酸铵和去垢剂/n(2)核酸提取液：含有内标，磁珠，捕获探针和Ec.T7引物(0.5μM/反应)/n捕获探针序列为：/n5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'/nEc.T7引物序列为：/n5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'/n(3)Ec.检测液a：检测液中含有dNTPs和NTPs等扩增所需组份，具体包含Tris 10～50mM,MgCI

【技术特征摘要】
1.一种利用RNA恒温扩增的大肠杆菌(Escherichiacoli)核酸检测试剂盒，试剂盒包括：a.
分别装有样本保存液、核酸提取液、Ec.检测液a、Ec.检测液b、SAT酶液、洗涤液、Ec.阳性标准品、Ec.阴性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和b.分隔并集中包装这些试剂瓶或者管的包装盒。
(1)样本保存液：含有硫酸铵和去垢剂
(2)核酸提取液：含有内标，磁珠，捕获探针和Ec.T7引物(0.5μM/反应)
捕获探针序列为：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
Ec.T7引物序列为：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
(3)Ec.检测液a：检测液中含有dNTPs和NTPs等扩增所需组份，具体包含Tris10～50mM,MgCI210～40mM,dNTP0.5～5mM,NTP1～10mM,PVP401～10％,KCl5～40mM；另外包含恒温扩增时必需的Ec.nT7引物(10μM/反应)和用于扩增内标的T7引物(3μM/反应)
Ec.nT7引物序列为：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
用于扩增内标的T7引物序列为：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
(4)Ec.检测液b：检测液中含有dNTPs和NTPs等扩增所需组份，具体包含Tris10～50mM,MgCI210～40mM,dNTP0.5～5mM,NTP1～10mM,PVP401～10％,KCl5～40mM；另外包含单链靶核酸检测探针(10μM/反应)和单链内标检测探针(10μM/反应)
Ec.检测液中的探针包...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，徐希媛，郑立，居金良，崔振玲，张帝，
申请(专利权)人：自然资源部第一海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37