一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N‑22菌株，所述N‑22菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No：19864。本发明专利技术的枯草芽孢杆菌N‑22生长活力高、代谢水平较为稳定，可广泛应用于饲料生产和食品加工等领域中。本发明专利技术分离的呕吐毒素降解微生物N‑22对于研究开发呕吐毒素的生物脱毒剂，对饲料生产和食品加工上具有十分重要的作用。

【技术实现步骤摘要】
一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及微生物降解
，具体涉及一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又称为呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生。其化学名为3α，7α，15-三羟基-12，13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，化学式为C15H20O6，纯品是一种无色针状结晶，具有很高的热稳定性和化学稳定性。呕吐毒素可污染多种谷物，如小麦、黑麦、燕麦、玉米等，且也能污染饲料原料和全价配合饲料(李笑樱等，2012)。呕吐毒素具有慢性和亚慢性毒性(AndrettaIetal.，2012)、急性毒性(霍星华等，2008)、免疫毒性(MikamiOetal.，2010)、神经毒性(FitzpatrickDWetal.，1988)等多种毒性作用，可对动物的消化系统、血液系统、中枢系统以及钙磷代谢均产生影响。饲料中低剂量的呕吐毒素会引起动物食欲下降、体重减轻、代谢紊乱等症状，高剂量可导致动物呕吐(BennettJWetal.，2003)。目前关于呕吐毒素的生化、毒性和作用方式有很多的研究报道，但是仍未构建有效防治或根除这些毒素的可行性办法。虽然物理，化学方法常被用来去除饲料中呕吐毒素的污染，如热处理，比重分选和清洗，但这些脱毒方法不仅效率低、效果差，还有可能带来二次污染、影响口感、降低粮食的营养价值等，因此“生物脱毒”开始被广泛关注。相关研究认为，最佳的脱毒方法是筛选有效微生物降解真菌毒素，该法可避免在食品加工过程中引入有害化学试剂，不会造成食品风味的改变和营养价值流失。生物脱毒可通过微生物或者酶将有毒的物质转化为低毒甚至无毒的代谢产物。例如，乳酸菌在一定条件下可以降解真菌毒素(El-NezamiHetal.，1998)；Motomura等从糙皮侧耳中提取并纯化了一种几乎能完全降解黄曲霉毒素的胞外酶，通过裂解黄曲霉毒素的苯环来达到生物脱毒作用(MotomuraMetal.，2003)，若能通过生物脱毒的方法对呕吐毒素的毒性基团进行改造从而降低毒性，则可实现高效、无污染的生产需求。
技术实现思路
本专利技术提供一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)N-22菌株，所述N-22菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCCNo：19864。所述菌株是在感染赤霉病的小麦籽粒上分离筛选得到的。所述菌株的分离筛选方法是：包括步骤：(1)取1g赤霉病菌污染的麦粒置于试管中，加9ml蒸馏水，室温孵育12小时，孵育期间震荡试管两到三次；(2)取孵育好的溶液1ml加至含200mg/L呕吐毒素的LB培养基中，在30℃、220rpm的条件下富集培养7天；(3)将富集培养后的菌液稀释为原浓度的10-4、10-5、10-6倍，涂于LB平板培养基上，过夜培养于30℃培养箱中；(4)挑选菌落生长密度适中的平板，挑取平板上所有的菌落至LB液体培养基中，30℃、220rpm培养12小时，得到所有待选的呕吐毒素降解菌株；(5)对所有待选的呕吐毒素降解菌株进行筛选，检测其呕吐毒素降解能力，筛选得到降解能力最高的菌株。其中所述步骤(5)中的筛选和检测过程具体为：a)将待选菌株在LB平板培养基上划线活化。b)挑取单菌落至LB液体培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养12小时。c)吸取20μl上述新鲜菌液接种至含有20mg/L呕吐毒素的MSM培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养96小时。d)用HPLC检测上述共培养混合液中呕吐毒素的含量，记录呕吐毒素降解效率。经过上述分离筛选过程后，最终得到一株降解能力最高的菌株，将其命名为N-22。其在含有呕吐毒素的环境中共培养96小时后，环境中呕吐毒素浓度即可降解至14mg/L以下。证明其具有高效降解呕吐毒素的能力。本专利技术还提供所述的N-22菌株在饲料生产或食品加工中的应用。所述应用是在饲料生产或食品加工过程中，将所述菌株加入到含有呕吐毒素的环境中共培养。随着共培养时间的延长，呕吐毒素浓度可持续降低。本专利技术的枯草芽孢杆菌N-22生长活力高、代谢水平较为稳定，可广泛应用于饲料生产和食品加工等领域中。本专利技术分离筛选得到的呕吐毒素降解微生物N-22对于研究开发呕吐毒素的生物脱毒剂、饲料生产和食品加工上具有十分重要的作用。微生物保藏说明本专利技术提供的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)N-22菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，菌株编号CGMCCNo：19864。保藏时间：2020年5月22日。详见所附的微生物保藏证明材料。附图说明图1为N-22菌株的呕吐毒素降解能力HPLC检测结果。图2为N-22菌株的16SrDNA鉴定图谱。具体实施方式为进一步说明本专利技术，结合以下实施例具体说明：本实施例通过多次分离筛选，从自然环境中筛选分离得到一株可高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌，命名为N-22(CGMCCNo：19864)，是从感染赤霉病的小麦籽粒上分离并筛选得到的。具体的，本专利技术菌株的分离筛选方法，包括：(1)取1g赤霉病菌污染的麦粒置于试管中，加9ml蒸馏水，室温孵育12小时，孵育期间震荡试管两到三次；(2)取孵育好的溶液1ml加至含200mg/L呕吐毒素的LB培养基中，在30℃、220rpm的条件下富集培养7天；(3)将富集培养后的菌液稀释为原浓度的10-4、10-5、10-6倍，涂于LB平板培养基上，过夜培养于30℃培养箱中；(4)挑选菌落生长密度适中的平板，挑取平板上所有的菌落至LB液体培养基中，30℃、220rpm培养12小时，得到所有待选的呕吐毒素降解菌株；将所有菌株冻存于20％甘油管中(-80℃)。(5)对所有待选的呕吐毒素降解菌株进行筛选，检测其呕吐毒素降解能力，筛选得到降解能力最高的菌株。其中所述步骤(5)中的筛选和检测过程具体为：a)将待选菌株在LB平板培养基上划线活化。b)挑取单菌落至LB液体培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养12小时。c)吸取20μl上述新鲜菌液接种至含有20mg/L呕吐毒素的MSM培养基中，在30℃，220rpm的条件下培养96小时。d)将上述共培养混合液在95℃高温加热15分钟，然后用12000rpm高速离心，取上清液与等体积40％甲醇溶液混合。用0.22μm有机相滤器过滤混合液以除杂质；将LB液体培养基做同样处理，以作为呕吐毒素浓度检测的阳性对照；用HPLC检测上述共培养混合液中呕吐毒素的降解量。HPLC检测使用WatersC185μm色谱柱(4.6×120mm)，流动相为A(甲醇)和B(超纯水)，V本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N-22菌株，其特征在于，所述N-22菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No：19864。/n

【技术特征摘要】
1.一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)N-22菌株，其特征在于，所述N-22菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCCNo：19864。


2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株是在感染赤霉病的小麦籽粒上分离筛选得到的。


3.根据权利要求2所述的菌株，其特征在于，所述菌株的分离筛选方法是：包括步骤：
(1)取1g被赤霉病菌污染的麦粒置于试管中，加9ml蒸馏水，室温孵育12小时，孵育期间震荡试管两到三次；
(2)取孵育好的溶液1ml加至含200mg/L呕吐毒素的LB液体培养基中，在30℃、220rpm的条件下富集培养7天；
(3)将富集培养后的菌液稀释为原浓度的10...

【专利技术属性】
技术研发人员：李广悦，李琲琲，任杰，杨秀芬，曾洪梅，袁京京，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11