双倍和三倍读出测定系统技术方案

本发明专利技术提供测定方法用于鉴定影响目的蛋白转录活性或影响目的蛋白稳定性的化合物。三倍读出测定系统可用来鉴定影响目的蛋白转录活性的化合物，使用三株细胞系以对非特异效果如插入基因两侧的序列和细胞毒性进行控制。双倍读出测定系统评估蛋白稳定性并利用报道蛋白和目的蛋白的融合蛋白。这些测定系统在鉴定影响转录因子和肿瘤抑制物的化合物方面是特别有用的。在特别的实施方案中，肿瘤抑制物ｐ５３是在研的靶蛋白。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请本申请要求2000年10月27日提交在审的临时申请USSN60/243,689的优先权，将其在此引作参考。
技术介绍
数十年来，药物筛选和生物测定一直用于药物和生物技术产业中，以甄别研究中的前导化合物成为新的药剂。在过去十年，通过诸如组合化学的技术，化学家在短的时间内合成大量化学化合物的能力已大大提高(对于组合化学领域的最新综述，请参见Geysen等Molec.Immunol.23709-715，1986；Houghton等Nature 35484-86，1991；FrankTetrahedron 489217-9232，1992；Bunin等Proc.Natl.Acad.Sci.USA914708-4712，1994；Thompson等Chem.Rev.96555-600，1996；Keating等Chem.Rev.97449-472，1997；Gennari等Liebigs Ann./Recueil 637-647，1997；Reddington等Science 2801735-1737，1998；分别在此引作参考)，并且这已扩充超出了传统筛选方法的容量。通常，需要筛选成千上万的化合物以鉴定那些具有所需的药物特性的化合物(如抗瘤活性、免疫抑制活性等)。许多目前通用的筛选为生化测定系统，其中将化合物加入到纯化或部分纯化的细胞抽提物中，以确定其是否具有所需的活性。与生化测定系统形成对照，目前通用的基于细胞的测定系统鉴定可透过细胞并在生理环境中起作用的生物活性分子。然而，基于细胞的测定筛选的主要缺陷之一是高的假阳性率，这是由细胞内的化合物的非特异效果产生的(例如，请参见Sarver等AIDS Res.Hum.Retroviruses 8659-666，1992；Witvrouw等Antimicrob.AgentsChemother.362628-2633，1992；分别在此引作参考)。假设基因调节在许多病态中具有根本的重要性，一种典型的基于细胞的测定在特异报道基因的控制下测量报道基因的活性。然而，抑制报道基因表达并不必然地显现特异性干扰启动子活性，而能反映细胞功能的非特异性抑制，例如由于细胞毒性。在癌症研究中一种特别重要的蛋白是核磷蛋白p53。据认为p53在超过50％的人类癌症中是突变的。p53基因中的突变已在结肠、肺、乳房、卵巢、膀胱及其他若干器官的肿瘤中找到。如果将p53基因的突变型导入到初级成纤维细胞中，这些细胞就变为无限增殖化细胞。野生型p53基因已显示抑制转化人细胞的生长，但是p53的致癌形式失去这种抑制功能。因此，p53基因已被称为“肿瘤抑制”基因。假设p53在肿瘤发生中起作用，它在新抗瘤剂研究中已变为重要的潜在靶子。野生型p53的功能可被干扰。例如，转化病毒性感染细胞能干扰p53蛋白产物。例如，转化某些株的人乳头瘤病毒(HPV)，并且已知干扰感染细胞中的p53蛋白的水平，这是因为所述病毒生产蛋白E6，其促进p53蛋白的降解。对p53还有兴趣，因为p53蛋白能够诱导某些细胞调亡。在凋亡或“编程性细胞死亡”中，一系列细胞的致死事件显示直接作为细胞DNA转录的结果发生。例如，与糖皮质激素接触的淋巴细胞通过编程性细胞死亡而死亡。当促激素去除时，激素敏感组织如乳房和前列腺就通过编程性细胞死亡而发生退化。特别地，最新的研究已显示，野生型(非突变)p53导入携带p53突变型的转化的细胞系，诱导细胞进行编程性细胞死亡，同时伴随着核DNA的分解。相信通过诱导编程性细胞死亡，p53可以抑制肿瘤发展，由此调节细胞生长。假设p53在各种各样的生理状态和病态中的重要性，有需要具有低背景的基于细胞的测定，所述测定可用于筛选化合物以鉴定p53的抑制剂和激活剂。此外，通过基因组研究快速增加新药物靶子以及化学化合物巨大文库的可利用度对提高筛选方法的新技术创造极大需求。专利技术概述本专利技术提供筛选化学化合物以甄别目的蛋白的激活剂和抑制剂(如转录因子、酶和肿瘤抑制物)的测定系统。一方面，本专利技术提供基于细胞的三倍读出测定系统用于鉴定影响转录活性的化合物。使用三种单独的细胞系，各细胞系含有不同改造的构建体。其中两种已转化有包含报道基因和已知与选择的转录因子结合的可调节的转录调节序列的构建体。两个细胞系各有不同的报道基因，以及将构建体整合进基因组的不同位置以控制侧翼序列对报道基因转录的影响。第三细胞系已转染有包含与组成型启动子可操作连接的第三报道基因的构建体。第三细胞系用来评估测试化合物的总的细胞毒性。将源自三种细胞系中的各系的至少一个细胞与测试化合物接触，测定报道基因的水平，并用来测试化合物对转录因子或转录因子途径的特异性。在特别优选的实施方案中，目的转录因子为p53。另一方面，本专利技术提供基于细胞双倍读数测定系统用于鉴定影响细胞中的蛋白稳定性/水平的化合物。在目的蛋白和第一报道蛋白之间创建融合蛋白。融合蛋白和第二报道蛋白在测试化合物加入的细胞系中表达。第二报道蛋白用来控制非特异效应如细胞毒性。测量所述两种蛋白(即融合蛋白和第二报道蛋白)的水平以评估测试化合物对目的蛋白的特异性。在特别优选的实施方案中，这两种蛋白翻译自被改造DNA构建体的相同mRNA转录物。在本专利技术这方面的特别优选的实施方案中，目的蛋白为p53。调节p53的一个关键点发生在蛋白水平。部分通过抑制由遍在蛋白—蛋白酶体途径的降解，影响其构型的肿瘤突变通常增加它的半衰期。与其肿瘤抑制中的关键作用相一致，包括人乳头瘤病毒E6癌蛋白的许多癌蛋白靶击p53蛋白并且改变其稳定性。另一方面，本专利技术提供p53的化学抑制剂和激活剂。利用本专利技术的三倍和双倍读出测定系统中的一种或两种系统，这种抑制剂和激活剂优选被鉴定和/或表征。在某些临床情形中，理想的是抑制p53的细胞效果。例如，p53依赖的编程性细胞死亡据信有助于用化疗抗癌治疗的毒性副作用。在本专利技术的某些优选的实施方案中，将p53抑制剂或激活剂提供在药物组合物的情形中。在优选的实施方案中，抑制剂和激活剂是小分子。另一方面，本专利技术提供试剂盒用于进行双倍和三倍读出测定。优选地，本专利技术试剂盒含有所有测定测试化合物对转录和/或蛋白稳定性/水平的影响所需的试剂。在特别优选的实施方案中，三倍读出测定中所用的试剂盒含有上述三种细胞系。双倍读出测定的试剂盒优选含有稳定转染有融合蛋白和第二报道蛋白的细胞系。在另一优选的实施方案中，本专利技术的试剂盒包含用于转染细胞系的DNA构建体。本专利技术优选的试剂盒也可含有其他试剂，如生长细胞的介质、酶底物(如荧光酶的底物)、DNA损伤化合物(如阿霉素)、人乳头瘤病毒E6癌蛋白、生长因子等。定义除非另外指明，下文所定义的术语具有下列含义“化合物”如本文所用的术语“化合物”或“化学化合物”可包括有机金属化合物、多核苷酸、寡核苷酸、肽、蛋白质、有机化合物、金属、过渡金属复合物以及小分子。在一特别优选的实施方案中，术语化合物是指小分子(例如，优选非肽和非寡聚的分子)并且排除肽、多核苷酸、过渡金属复合物、金属以及有机金属化合物。“组成型启动子”术语“组成型启动子”是指总处于“开启”状态下的启动子。换句话说，与组成型启动子可操作连接的基因总能被转录成mRNA。“构建体”术语构建体是指任何已经人工操作的多核苷酸。具体而言，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定影响受ｐ５３调节的基因转录的化合物的方法，所述方法包含下列步骤：提供第一株含有构建体的细胞系，该构建体包含与第一报道基因可操作连接的ｐ５３结合元件；提供第二株含有构建体的细胞系，该构建体包含与第二报道基因可操作连接的 ｐ５３结合元件；提供第三株含有构建体的细胞系，该构建体包含与第三报道基因可操作连接的启动子；将测试化合物与三株细胞系中的各株的细胞接触；以及确定测试化合物对三种报道基因表达的影响。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金泰国，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]