配子发生制造技术

本发明专利技术涉及通过生成减数分裂胜任细胞来诱导配子发生的活体外方法。还提供用于本发明专利技术的所述方法中的试剂和试剂盒。本发明专利技术适用于医学领域，特定来说适用于不孕症的研究和治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】配子发生
本专利技术涉及活体外诱导配子发生的方法。还提供用于本专利技术的所述方法中的试剂和试剂盒。本专利技术适用于医学领域，特定来说适用于不孕症的研究和治疗。
技术介绍
配子发生是借以产生配子的过程。在动物中，配子发生通过性腺(雄性为睪丸；雌性为卵巢)中的减数分裂胜任生殖母细胞的分裂和分化进行。在雄性中，精子发生在睪丸中发生，以在涉及减数分裂和有丝分裂的多步骤过程中由精原干细胞(spermatogonialstemcell,SSC)产生精子。SSC源自产后睪丸中的生殖母细胞，且这些生殖母细胞转而源自原始生殖细胞(primordialgermcell,PGC；Phillips等人,2010)，其在胚胎发生期间迁移至生殖嵴。在小鼠中，PGC(生殖母细胞的胚胎前体)的特化在胚胎第6.25天(E6.25)开始1。在特化之后，新生PGC进行明显的全域表观遗传变化2-9，包括基因组5-甲基胞嘧啶(5mC)的全域降低3,6,7,10。PGC在跨发育中胚胎各个期间的迁移之后，一旦到达发育中胚胎性腺，则继续进行包含全域DNA去甲基化的表观遗传再程序化。性腺PGC的这个DNA去甲基化中牵涉的分子机制已成为重点研究的焦点3,4,6,12-19,21，且近年来公开的观测表明，5mC加氧酶Tet1是参与性腺PGC中正确进展DNA去甲基化的关键因子12,14,16,17。然而，这个表观遗传再程序化的精确性质仍然难以理解。最新研究已显示(Hill等人,2018)，性腺表观遗传再程序化关键性地参与PGC-生殖母细胞的转化，所述转化是产生减数分裂胜任生殖母细胞(且因此允许配子发生的起始)所需要的。重要的是，性腺再程序化过程代表一种直到近年来才仅在性腺体细胞环境下被克服的屏障5,24,25,27。最新研究已报道通过若干生殖系相关基因的诱导性表达将体细胞前体细胞转化为减数分裂胜任细胞(Medrano等人,2016)。其它研究已将Tet1鉴定为在雌性配子发生的活化期间调控某些生殖系相关基因方面的关键因子16。然而，尚未显示对Tet1表达的操纵足以将体细胞前体细胞转化为减数分裂胜任细胞。在人类中，不孕症是一个重大健康问题。举例来说，雄性不孕症影响7％的群体，其中约10％的不育男性为无精子症(Galdon等人,2016)。减数分裂胜任细胞的提供代表活体外再现配子发生的一个重要步骤，其将应用于研究和医学，特定来说在不孕症的情形下。
技术实现思路
本专利技术人已发现，有效活化从PGC进展为生殖系发育的生殖母细胞阶段所需的一组基因(所述基因在本文中和在Hill等人2018中称为“生殖系再程序化应答基因(germlinereprogramming-responsive(GRR)基因)”)需要两个不同生物化学条件。这些基因(也为体细胞前体细胞、多能细胞或早期生殖细胞转化为减数分裂胜任细胞所需的)可通过首先减少DNA甲基化且其次去除多梳蛋白驱动的抑制来活化。一旦这些生物化学条件就位，则包含表观遗传活化因子Tet1的转录因子和活化因子能够驱动GRR基因表达。转录活化因子(如Tet1)的募集和/或GRR基因的表达指示前体(体细胞)细胞转化为减数分裂胜任细胞。因此，在第一方面中，本专利技术提供一种生成减数分裂胜任细胞的活体外方法，所述方法包括：(i)提供前体细胞，(ii)抑制所述前体细胞的基因组DNA的甲基化，(iii)用多梳蛋白抑制复合物的抑制剂处理所述前体细胞，且随后(iv)使所述前体细胞繁殖一段时间且在适合于所述前体细胞变为减数分裂胜任细胞的培养条件下繁殖；其中步骤(ii)和步骤(iii)可以同时或按任一次序依序进行。在一些实施例中，前体细胞是来源于已从个体获得的样本。前体细胞可以是干细胞、原始生殖细胞样细胞(primordialgermcell-likecell,PGCLC)或早期生殖细胞。在一些实施例中，干细胞是诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstem(iPS)细胞)或精原干细胞在一些实施例中，抑制步骤(ii)和处理步骤(iii)使得在繁殖步骤(iv)期间诱导前体细胞表达生殖系再程序化应答(GRR)基因。GRR基因的表达可能与转录活化因子(例如Tet1)的募集相关或通过转录活化因子的募集来诱导。Tet1可由前体细胞表达，和/或Tet1可外源地提供(例如通过递送外源地表达Tet1的核酸、通过增强或刺激Tet1的内源性表达和/或通过以外源性蛋白质形式提供Tet1)。外源提供的Tet1可呈靶向一个或多个特定基因组区域的融合构建体形式。举例来说，Tet1融合构建体可靶向参与表达本文所公开的一个或多个GRR基因中的的启动子或增强子序列。提供有效水平的Tet1作为转录活化因子增强GRR基因的表达。本专利技术方法使得能够使GRR基因表达得到增强，且这些方法可包含增加或诱导Tet1表达和/或将Tet1靶向一个或多个GRR基因。本专利技术方法也可包含检测和/或量化细胞中的一个或多个GRR基因的表达水平。GRR基因在表1中列出。用于检测和/或量化表达水平的方法为本领域所熟知的。举例来说，可例如通过RT-PCR测量基因的mRNA水平。可例如通过如ELISA的测试测量蛋白质表达水平。可在前体细胞转化为减数分裂胜任细胞之前、期间或之后测量一个或多个GRR基因的表达。优选地，测量在步骤(iv)之后减数分裂胜任细胞中的一个或多个GRR基因的表达。待测量的GRR基因可以是以下中的一个或多个：Dazl、Hormad1、Sycp2、Sycp3、Mae1、Fkbp6(参见表1)。在本专利技术的一些实施例中，多梳蛋白抑制复合物的抑制剂是PRC1抑制剂(意味着PRC1复合物被选择性地抑制)。在本专利技术的其它实施例中，多梳蛋白抑制复合物的抑制剂是PRC2抑制剂(意味着PRC2复合物被选择性地抑制)。在又其它实施例中，多梳蛋白抑制复合物的抑制剂抑制PRC1和PRC2两个。在一些实施例中，多梳蛋白抑制复合物的抑制剂是PRT4165。在其它实施例中，多梳蛋白抑制复合物的抑制剂是RNAi分子，其选择性地降低多梳蛋白抑制复合物的组分(例如PRC1或PRC2的组分)的表达。在本专利技术的一些实施例中，通过用降低基因组DNA甲基化的药剂处理前体细胞，来进行DNA甲基化的抑制(所述方法的步骤(ii))。在本公开的情形下，‘处理’细胞应理解成意味着‘接触’细胞，即使细胞暴露于药剂。此外，‘抑制’包含‘降低’和‘完全阻止’两个。举例来说，可用DNA甲基转移酶抑制剂、用阻止DNA甲基化沉积的药剂或用抑制DNA甲基化维持的药剂，来处理(接触)前体细胞。5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dc)是一种抑制DNA甲基化且还抑制DNA甲基化维持的药剂。在其中降低基因组DNA甲基化的药剂是DNA甲基转移酶抑制剂的实施例中，DNA甲基转移酶抑制剂可以是DNMT1抑制剂。举例来说，DNA甲基转移酶抑制剂可以是SGI1027或5-氮杂胞苷。或者，DNA甲基转移酶抑制剂可以是RNAi分子，其降低DNA甲基化机制的组分的表达。RNAi分子可以是siRNA分子或m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生成减数分裂胜任细胞的活体外方法，所述方法包括：/n(i)提供前体细胞，/n(ii)抑制所述前体细胞的基因组DNA的甲基化，/n(iii)用多梳蛋白抑制复合物的抑制剂处理所述前体细胞，且随后/n(iv)使所述前体细胞在一段时间内且在适合于所述前体细胞变为减数分裂胜任细胞的培养条件下繁殖；/n其中步骤(ii)和步骤(iii)可以同时或按任一次序依序进行。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171222 GB 1721724.11.一种生成减数分裂胜任细胞的活体外方法，所述方法包括：
(i)提供前体细胞，
(ii)抑制所述前体细胞的基因组DNA的甲基化，
(iii)用多梳蛋白抑制复合物的抑制剂处理所述前体细胞，且随后
(iv)使所述前体细胞在一段时间内且在适合于所述前体细胞变为减数分裂胜任细胞的培养条件下繁殖；
其中步骤(ii)和步骤(iii)可以同时或按任一次序依序进行。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述前体细胞是来源于已从个体获得的样本。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述前体细胞是干细胞或原始生殖细胞样细胞(PGCLC)。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述干细胞是iPS细胞。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前体细胞表达Tetl，或在步骤(i)和/或(ii)之后开始表达Tetl。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抑制步骤(ii)和所述处理步骤(iii)足以诱导所述前体细胞在繁殖步骤(iv)期间表达生殖系再程序化应答(GRR)基因。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述GRR基因的所述表达与转录活化因子的募集相关或通过转录活化因子的募集诱导。


8.根据权利要求7所述的方法，其中所述转录活化因子是Tetl。


9.根据权利要求5或权利要求8所述的方法，其中外源地提供或增强Tetl表达。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)之前或在步骤(iv)期间，将Tetl蛋白外源地引入到所述前体细胞中。


11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述外源提供或外源引入的Tetl是靶向一个或多个特定基因组区域的Tetl融合构建体。


12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括：
(v)检测所述细胞中的一个或多个GRR基因的表达水平。


13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(v)是在步骤(iv)后在所述减数分裂胜任细胞上进行。


14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中多梳蛋白抑制复合物的所述抑制剂是PRC1抑制剂和/或PRC2抑制剂。


15.根据权利要求14所述的方法，其中多梳蛋白抑制复合物的所述抑制剂是PRC1抑制剂。


16.根据权利要求15所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·哈吉科瓦，P·希尔，H·利奇，
申请(专利权)人：英国研究与创新署，
类型：发明
国别省市：英国;GB