本发明专利技术描述了一种仪器和方法，在其帮助下，特定的生物颗粒和可溶性的生物分子能被识别和使用合适的载体和已知的固定方法从流体中分离。该仪器可以间断地使用，也可直接和连续处理流体。本发明专利技术应用于动物，生物技术（包括生物学研究）和医疗诊断领域。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种从流体中分离细胞、生物颗粒和/或分子的方法和仪器。通过本专利技术并使用合适的载体和已知的固定方法，能识别和分离特殊的生物颗粒。本专利技术应用于动物，生物技术(包括生物学研究)和医疗诊断领域。
技术介绍
在很多领域，从流体中分离细胞、生物颗粒和/或分子是很重要的，且许多方法已为人们所熟知。使用荧光激活细胞分选(FACS)的方法进行细胞分析和细胞分离已经很多年了。该方法是一种通过表面标志分析特殊细胞群的较佳方法。但应用FACS分离大量细胞时会产生问题。包含细胞的介质必须高度稀释，对大量的细胞分离的时间相对长，且不能满足无菌条件。总之，该方法成本相当昂贵。近10多年来，磁性分离被不断用于识别和分离生物颗粒和细胞。该方法要么是俘获分子被铁俘获要么包含铁芯的微粒被俘获分子包覆。分离通过强磁场进行。免疫-磁性分离，通过Dynal和Miltenyi Biotec已成功商业化，已经建立了它自己简单、相对有价值的细胞分离方法。特别相对于流式细胞仪，磁性分离已经证明它分离相对较少细胞类型的价值，例如，对作怀孕诊断的母亲血液中胎儿细胞的分离。进一步的应用是在手术切除主要的肿瘤后检测血液中的肿瘤细胞以作进一步治疗。以治疗为目的，现在某些恶性血液形式系统疾病病人的先天的CD34+造血外周血干细胞一般从再移植获得。较佳的方法是通过特异性抗体偶联的磁珠除去白细胞。因为在血液/细胞捐献期间的细胞分级，许多系统都可通过血细胞的不同尺寸和特定密度在重力场中(离心法)进行分离。所有这些分类法的缺点是它们不能持续地运作，也就是说，采集血液或淋巴细胞样品并和免疫-磁性颗粒培养。通过分离和洗脱，细胞从磁性颗粒分离，该细胞才能用于治疗的目的。关于FACS和MACS的全面评述在″Fow Cytometry and Sorting“(Ed.Melamed et al.，Wiley & Sons，Inc.，New York，1990)有述。其它的分离和/或去除细胞的方法在EP 12311956A2，US 6900029，US6432630，US 20020012953A1，DE 10022635A1，US 5246829，US 5739033，US 5763203，EP 0016552A1，WO 00/38762，EP 0502213B1以及EP0554460B1中有述。
技术实现思路
本专利技术的目的是发展一种简单的分离细胞、生物颗粒和其它分子的系统，该系统能用于动物以及生物
，包括生物学研究和医疗诊断。本专利技术是根据权利要求1，14和29-30来实现的，从属权利要求是不同的优选形式。本专利技术描述了一种简单的分离方法，该方法可用于任何作用于混合物表面的功能性固定的特异性基团的分离。实际的分离通过颗粒尺寸的分选完成(过滤，筛)。为实现上述目的，使用特异性基团与固相载体偶联的标准方法。固相载体使用已知的生物高聚物，如来自器官的或合成的聚合物的膜或颗粒。其表面能生物相容且包含胶原质，清洗蛋白质，清洗肽，多聚糖，如壳聚糖、海藻、葡聚糖、纤维素、粘多糖或合成聚合物，如聚苯乙烯、聚酯、聚醚、聚酸酐、丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚醋酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烷、聚四氟乙烯(PTFE)或聚氨酯。该表面是能生物降解的或非生物降解的。用于细胞表面靶分子的结合的特异性基团可以是天然的或合成的，比如抗原、抗原片段、肽、多肽、糖肽、受体、甾体、激素、分裂素、抗体、超抗体、生长因子、细胞因子、凝集素、病毒蛋白、黏附分子或趋化因子。作为特例，至少使用一种抗体或抗体片段，并通过间隔和链将它们与特异性基团共价结合或固定。载体物质可显示任意几何形状。膜如毛细血管或微粒提供了表面大的优点。如以下所述，微粒的直径为＞10μm＜800μm，较佳的是使用50-500μm。而对于其他目的，也可使用较大或较小的颗粒。被特异性基团激活的颗粒(例如抗CD34或CD1d的抗体，或抗HIV-gp120抗体)将体细胞基因与血液相接触，用传统的抗凝血剂处理。这是在一个单独的反应区进行。如果反应区安置在体外循环，则与安全技术相关的连接管，阀门，过滤器和水泵可确保系统在相应的抗凝血剂下对病人作无副作用的操作。靶细胞用功能化的微小颗粒结合。此处所述的微小颗粒的分离是利用膜(筛)的流体压力，最好是管子的形状使血液成分无障碍地通过(小孔尺寸＞10μm＜800μm)，但留下微小颗粒。过滤可通过垂直压力和切线压力来实现。保留在内腔的颗粒返回或导入到反应容器中以用于分析或制备。当血液停止流动时，用反应容器从微粒中分离细胞。以这种方式分离的分散细胞能从颗粒中以相同的程序去除，可以供诊断应用。进一步的应用是目的性分离不同类型的细胞，其目的是随时将需要表面分子的有疑问的细胞类型和/或像其它类型的细胞因子的生物分子共同培养以实现它们所需要的功能。为了达到足够的因必需的细胞-细胞接触的需要的靶细胞的亲近，将许多特异性基团结合在颗粒上。本专利技术应用的特异细胞可以是T细胞，B细胞或干细胞。本方法可以间断和连续地使用。根据材料、直径和表面修饰在颗粒设计上的高度可变性，可导致在动物，医疗诊断，以及生物技术和生物研究方面上的巨大不同。具体实施例方式实施方式1从大鼠全血中分离CD4阳性细胞腹水抗体(RIB 5/2)根据Millipore Montage的抗体纯化试剂盒(LSK2 ABG20)的方案完成。纯化后用SDS变性胶(10％)检测抗CD4抗体和聚丙烯(PMA)颗粒的偶联1、1ml PMA(颗粒直径＝40μm+/-10μm；10mg/ml；COOH/PEG-COOH修饰)离心2分钟，3,000xg，去掉上清吸入在1ml 0.1M MES pH 6.3的溶液中。2、将2mg EDC和2.4mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.5ml 0.1M MES pH6.3的缓冲溶液中，加到PMA颗粒的悬浮液中。在室温旋转(颗粒的活化)下培养1小时。3、分离PMA颗粒离心，用0.1M MES r pH 6.3溶液洗脱两次。4、吸活性的PMA颗粒到有100-150μg的抗体的1ml 0.1M MES pH 6.3的缓冲溶液中；在室温偶联16小时(过夜)。5、加入100μl 1M的氨基乙醇培养1小时，中和空余的结合位点。6、用PBS洗脱功能化的PMA颗粒，重复3次，离心，分离。7、吸收小鼠IgG PMA颗粒到1ml PBS中，4℃下贮存。通过羊抗小鼠抗体的PE标记检测抗体的偶联。(附图说明图1)从全血的CD4阳性细胞中分离特异性细胞1、4ml抗凝血的大鼠全血与1ml(1mg颗粒)功能化的抗CD4 PMA颗粒的悬浮液混合。2、在室温摇动培养60分钟。3、通过带细胞筛(40μm)的特殊的腔体过滤血液颗粒混合物从全血分离抗CD4 PMA颗粒(有或没有结合细胞)。4、用30ml PBS(1％FCS)洗涤抗CD4 PMA颗粒。5、从筛腔吸颗粒到约1ml PBS中，旋转(混合)15-20秒。6、移去颗粒样品做显微分析(图2)7、在用抗CD4 PMA颗粒处理之前和之后，用FACS分析大鼠全血中的白细胞部分。分离和评定来自颗粒的细胞1、将粘附细胞的抗CD4 PMA颗粒通过小心的离心沉淀。2、吸沉淀物到PBS，2mM EDTA，3mM巯基乙醇和2本文档来自技高网...
【技术保护点】
应用于动物、生物技术（包括生物学研究）和医学诊断目的的，用来从体液中离析细胞、生物颗粒和／或分子的器具，包含： ａ．生物相容性材料的反应容器，在其中放置细胞、颗粒和／或分子的混合物， ｂ．功能化的微颗粒，其能识别并结合所需的细胞、生物颗粒和／或分子群体， ｃ．基于一层或多层带孔的膜的颗粒分离系统，其允许细胞、生物颗粒和／或分子通过，但不允许微颗粒通过， ｄ．以及，为了连续使用，各种软管系统、膜、泵和阀门，以便能进行所有的离析、分离、加工和移除细胞、生物颗粒和／或分子的动作。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：汉斯维尔纳海因里希，
申请(专利权)人：汉斯维尔纳海因里希，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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