一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架及脱细胞基质人工血管制造技术

本发明专利技术属组织工程领域，具体涉及一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架，包括添加了细胞因子、小分子药物或miRNA的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括TGF‑β、VEGF、PDGF生长因子中至少一种；所述小分子药物包括DMOG的至少一种；所述miRNA包括miRNA‑221、miRNA‑146a的至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料；所述培养条件调控手段包括低氧诱导培养。本发明专利技术的有益效果在于，能够快速制备脱细胞基质人工血管，并且制备的脱细胞基质人工血管再生性好，远期通畅率高。

【技术实现步骤摘要】
一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架及脱细胞基质人工血管
本专利技术属组织工程领域，具体涉及一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架及脱细胞基质人工血管。
技术介绍
在我国乃至世界范围内，心血管疾病的患病率和死亡率高居非传染性疾病之首，远超肿瘤、慢性呼吸系统疾病和糖尿病等其他疾病。《中国心血管疾病报告2018》指出，我国现阶段推算心血管病人数超过2.9亿，形成了严重的公共卫生问题，造成了巨大的健康与经济负担。针对心血管疾病的临床治疗手段主要包括血管扩张和血管移植手术，血管移植手术中最为理想的是使用患者自体血管，但由于患者健康状况、能够获取的血管长度等限制，满足手术要求的健康血管往往难以获得。口径大于6mm的人工血管已广泛应用于临床，术后通畅率较高，但用于外周血管搭桥或替换的小口径(内径<6mm)人工血管至今没有商业化的产品。因此，研发新型小口径人工血管以满足临床需求，具有重要的现实意义。目前，常用的小口径人工血管支架材料主要有两大类,即以聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)(PLCL)等为代表的合成聚合物材料，和以胶原、脱细胞基质材料为代表的天然材料。合成聚合物材料有着较为良好的机械性能，可加工性强，但作为长期植入的血管替换材料而言生物活性较差，不利于血管组织的完全再生，容易引起钙化，从而导致移植失败，所以仍需进行进一步活性修饰。脱细胞基质(Decellularizedextracellularmatrix，dECM)是近年来组织工程血管材料研究的热点之一。将取材与动物体内的血管脱细胞后，其dECM材料保留了大部分具有生物活性的胞外基质蛋白，如胶原蛋白和弹性蛋白等，同时去除了活细胞带来的免疫原性。能够有效促进血管组织再生。但是，天然血管往往无法与临床上所需移植血管的特定口径或长度相匹配。另外，天然dECM材料往往力学性能较差，脱细胞的过程还会不可避免的再次降低材料的力学性能，且其脱细胞后孔隙率小，结构致密，不利于宿主细胞的浸润和生长，极大限制了天然dECM材料在血管移植领域的应用。利用体外生物反应器构建组织工程人工血管能够克服天然组织脱细胞基质的缺点，充分发挥dECM材料的优势。体外生物反应器以材料作为支架，在其上种植种子细胞，材料为细胞的生长和增殖提供了空间，而细胞按照材料支架的构形增殖，种子细胞分泌细胞外基质逐渐替代降解的材料，最终成为具有生物功能的血管组织。在以往研究中，有研究者把平滑肌细胞(VSMCs)种植在聚乙醇酸(PGA)血管支架上，将其放入生物反应器中，经过八周的培养后进行脱细胞处理，获得了具有良好生物相容性的dECM人工血管。但是，利用这种方法制备的血管材料需要在体外培养时间长达八周，增加了制造和维护成本的同时还容易因长时间培养细胞导致染菌等问题而失败，一定程度上限制了其应用与商品化。如何在体外实现快速制备dECM人工血管，是目前研究中亟待解决的问题。综上所述，调控种子细胞迁移、增殖和胞外基质的分泌是体外组织工程人工血管制备的关键。为了解决上述问题，我们在材料上种植血管细胞并利用生物反应器对其进行培养，生物反应器提供的流体力学刺激和环境刺激能够促进种子细胞的增殖和胞外基质分泌。除了力学和培养环境的控外，在组织工程血管的制备过程中，通过细胞因子、小分子药物或miRNA等的添加，对种子细胞状态和功能进行调节，实现促进所种植的血管细胞快速增殖及其ECM的沉积，提高体外反应器制备人工血管的效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种促进细胞快速增殖及促进其ECM沉积的血管支架、血管支架的制备方法及脱细胞基质人工血管，所得产品能够用于小口径血管移植和搭桥手术，解决现有小口径人工血管再生差、远期通畅率低的问题。本专利技术公开了一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，包括添加了细胞因子、小分子药物或miRNA的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括TGF-β、VEGF、PDGF生长因子中至少一种；所述小分子药物包括DMOG的至少一种；所述miRNA包括miRNA-221、miRNA-146a的至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料；所述培养条件调控手段包括低氧诱导培养。进一步地，所述管状聚合物纤维支架为侧壁多孔的结构。进一步地，所述可降解聚合物材料采用聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原中一种或几种的任意比例混合物。优选地，所述管状聚合物纤维支架，内径为2-10mm，壁厚为200-1000μm，长度为5-40cm。进一步地，所述管状聚合物纤维支架为单层或双层结构。优选地，所述管状聚合物纤维支架采用双层结构时，内层为周向排列的熔融纺丝纤维，纤维直径10-60μm，有助于血管平滑肌细胞的仿生排列和中膜组织再生；外层为无序排列的静电纺丝纤维，纤维直径1-10μm。此双层结构有助于保持血管支架的拉伸强度并防止渗漏。本专利技术还公开了一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架的制备方法，包括以下步骤：制备管状聚合物支架，所述管状聚合物纤维支架的制备方法包括：熔融纺丝、3D打印、静电纺丝、编织、浇铸中的至少一种；添加细胞因子、小分子药物或miRNA，所述活性因子的添加方式包括：在聚合物溶液中添加、在支架表面吸附、自组装或化学键接枝固定。添加的细胞因子、小分子药物或miRNA可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质，有利于实现血管移植后的重构和再生。本专利技术还公开了一种快速制备的脱细胞基质人工血管，利用如下方法制备：首先接种平滑肌细胞或内皮细胞，尽量使细胞均匀分布在整个血管支架的纤维空隙内，静态培养1天，使接种的细胞完全贴附和伸展，随后置于流动培养生物反应器，与循环管路连接，逐渐加大液体流速、剪切力和压力至与生理水平相当的条件，持续培养1-6周。培养结束后，对接种细胞并培养后的活性人工血管进行温和的脱细胞处理，确保细胞的彻底脱除，同时最大程度保留活性的细胞外基质，并且不破坏内部的聚合物纤维原始结构。进一步地，所述平滑肌细胞为人源iPS，通过诱导分化制备的平滑肌细胞或内皮细胞。iPS的制备及其向平滑肌细胞或内皮细胞定向诱导分化遵循商品试剂盒的使用说明。进一步地，所述脱细胞处理的方法包括：SDS法或液氮冻融法。优选地，SDS法的操作步骤如下：将组织工程血管浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上，室温缓慢振荡12h，之后用无菌的生理盐水冲洗除去SDS，随后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中，其中酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/LMgCl2，0.2mol/LCaCl2和0.1mol/LpH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成；DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，包括添加了细胞因子、小分子药物或miRNA的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括TGF-β、VEGF、PDGF生长因子中至少一种；所述小分子药物包括DMOG的至少一种；所述miRNA包括miRNA-221、miRNA-146a的至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料；所述培养条件调控手段包括低氧诱导培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，包括添加了细胞因子、小分子药物或miRNA的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括TGF-β、VEGF、PDGF生长因子中至少一种；所述小分子药物包括DMOG的至少一种；所述miRNA包括miRNA-221、miRNA-146a的至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料；所述培养条件调控手段包括低氧诱导培养。


2.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述管状聚合物纤维支架为侧壁多孔的结构。


3.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述可降解聚合物材料采用聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原中一种或几种的任意比例混合物。


4.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔德领，闫泓雨，程曲汉，王恺，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12