一种废水的发育神经毒性评估方法技术

本发明专利技术公开了一种废水的发育神经毒性评估方法，将huc：eGFP转基因斑马鱼胚胎暴露于待检测的废水中至24hpf，将暴露后的胚胎取出后，于荧光倒置显微镜下观察，并采集图像进行分析。与现有技术相比，本发明专利技术基于转基因斑马鱼的评估手段，借助生物显微技术，即绿色荧光(GFP)易于检测的特性，实现了废水发育神经毒性的直接可视化及半定量检测。本发明专利技术不仅适用于废水发育神经毒性评估，也适用于化学品及其他众多环境水体的毒性评估。且其具有操作简单、快速高效等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种废水的发育神经毒性评估方法
本专利技术属于水质评估领域，具体涉及一种废水的发育神经毒性评估方法。
技术介绍
目前对废水的监控仍以化学分析法为主。从简单的总有机碳(TOC)、总磷(TP)、总氮(TN)测定等到复杂的色谱、质谱及色谱-质谱连用技术均只能大致了解污染物的浓度信息，并且往往需要昂贵的化学药品和设备，同时分析过程中也容易引入二次污染[1]。更重要是这种纯粹的化学方法无法提供有关暴露时间变化或污染物相互作用所引起的生物毒性危害信息[2]。因而生物毒性测试被越来越多的应用于废水水质评估及生态风险评估中。由于生物在遭受废水暴露时表现出物种、器官及生物系统敏感性差异巨大，生物毒性测试也成为了一个具有多物种、多毒性终点及多检测手段等特点的复杂评估体系。发育神经毒性则其中是一个与物种繁殖高度相关的毒性终点，决定着后代生物的生存能力。而目前废水的发育神经毒性却受到较少关注。现有发育神经毒性的检测方法主要由运动行为分析、免疫组织化学、酶联免疫反应(ELISA)或是其他分子生物学手段。廖等人借助运动检测仪器记录并分析了氯胺酮和甲基苯丙胺对斑马鱼的运动行为特征以此评估其发育神经毒性[3]。此类方法评估的终点过于末端，敏感性较差，实验过程复杂，需配备专门仪器。乙酰胆碱酯酶(AChE)是另一个常用来反应污染物神经毒性的生物标志物。毛等人在评价邻苯二甲酸二正丁酯和铅的联合暴露对幼鼠的神经发育毒性研究中采用ELISA测定了AChE水平[4]。该类方法所使用生物检测试剂盒价格较为高昂。同样的免疫组织化学及分子生物学手段也往往花费较高，实验操作复杂。尤其是应用于废水发育神经毒性评估中时，较高的价格往往意味着难以普及，而复杂的实验操作意味着更大的劳动投入。因此开发一种操作简单，成本低廉并且快速高效的废水发育毒性评估十分必要。参考文献[1]Park,J.；Brown,M.T.；Depuydt,S.；Kim,J.K.；Won,D.S.；Han,T.,ComparingtheacutesensitivityofgrowthandphotosyntheticendpointsinthreeLemnaspeciesexposedtofourherbicides.EnvironmentalPollution2017,220,818-827.[2]Lee,H.；Park,J.；Shin,K.；Depuydt,S.；Choi,S.；DeSaeger,J.；Han,T.J.,Applicationofaprogrammedsemi-automatedUlvapertusabioassayfortestingsingletoxicantsandstreamwaterquality.AquaticToxicology2020,221.[3]Liao,P.H.；Hwang,C.C.；Chen,T.H.；Chen,P.J.,Developmentalexposurestowaterborneabuseddrugsalterphysiologicalfunctionandlarvallocomotioninearlylifestagesofmedakafish.AquaticToxicology2015,165,84-92.[4]Mao,G.H.；Liu,H.Y.；Ding,Y.Y.；Zhang,W.J.；Chen,H.；Zhao,T.；Feng,W.W.；Wu,X.Y.；Yang,L.Q.,Evaluationofcombineddevelopmentalneurologicaltoxicityofdi(n-butyl)phthalatesandleadusingimmaturemice.EnvironmentalScienceandPollutionResearch2020,27,(9),9318-9326.
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种废水的发育神经毒性评估方法，以拓展现有废水安全性评估中的毒性考察角度及方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种废水的发育神经毒性评估方法，将huc:eGFP转基因斑马鱼胚胎暴露于待检测的废水中至24hpf，将暴露后的胚胎取出后，移入黑色96孔板中，每孔一颗胚胎，每孔加入50μLE3培养基溶解的质量比为0.016％三卡因溶液以麻醉胚胎，于荧光倒置显微镜下观察，并采集图像进行分析。其中，所述的huc:eGFP转基因斑马鱼胚胎的获取方法包括如下步骤：S1：将huc:eGFP转基因斑马鱼成鱼饲养于带加热泵，紫外灯及曝气装置的循环水系统中或普通的鱼缸中，雌鱼和雄鱼要分开养殖，其养殖条件均一样：每两天更换三分一的换养殖水，水温为28℃，光照周期为14/10h，即14h光照，10h黑暗，养殖密度为5-8尾/L，每天中午和晚上各喂食一次活体丰年虾；S2：每天第二次喂食结束后30min后进行配鱼，鱼缸盛水量为鱼缸体积的三分之二，每个鱼缸中为两雌一雄或一雌一雄，鱼缸中间用隔板将雌雄分开，次日光照开启时抽去隔板，13～20min(优选15min)雌鱼开始排卵，在30～40min(优选30min)时收集胚胎，去除死卵、粪便和其它杂物，用E3培养基洗涤数次，转移到28.5℃恒温培养箱中待用。S1中，所述的丰年虾为丰年虾冻干卵购自潍坊市泛饭爱宠物用品有限公司，于浓度为20g/L的盐水中孵化，持续曝气，孵化量为50mg丰年虾卵/尾。S2中，所述的用配鱼专用缸进行配鱼，所述的配鱼专用缸分为外缸和内胆两部分，内部底部有很多小孔以方便胚胎漏下避免亲鱼误食。S3中，所述的E3培养基中，各组分的浓度为：5mMNaCl，0.17mMKCl，0.33mMCaCl2·2H2O，0.33mMMgSO4·7H2O；溶剂为水，pH为7.2～7.4。其配置方法为：称取以下物质溶于1L水中：NaCl292.5mg；KCl12.665mg；CaCl2·2H2O48.51mg；MgSO4·7H2O81.18mg；NaHCO3调节pH至7.2～7.4。优选地，将废水进行预处理后，才得到待检测的废水，包括(1)调节pH至胚胎适宜水平；(2)过滤杂质；(3)再将野生型斑马鱼胚胎暴露于废水中，记录胚胎死亡情况，根据致死效应评估结果，对废水进行稀释或浓缩等不同方式的前处理浓缩或稀释至合适的致死率，具体的如下：步骤(1)中，添加NaHCO3调节pH为7.0～7.6。优选地，通过添加适量NaCl调节废水电导率为450～600μs/cm。步骤(2)中，将步骤(1)处理后的废水先通过0.45μm的滤膜过滤，将滤液再通过0.22μm的滤膜过滤。其中，若杂质不多，可以不用过滤，或仅采用0.45μm的滤膜过滤，或仅采用0.22μm的滤膜过滤。步骤(3)中，将野生型马斑鱼胚胎移入孔板中，每孔10颗，移除孔板中胚胎的培养液，再向孔板中加入2mL步骤(2)处理后的废水，使得转基因斑马鱼持续在废水中暴露至24hpf，观察胚胎死亡数量，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，将huc：eGFP转基因斑马鱼胚胎暴露于待检测的废水中至24hpf，将暴露后的胚胎取出后，于荧光倒置显微镜下观察，并采集图像进行分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，将huc：eGFP转基因斑马鱼胚胎暴露于待检测的废水中至24hpf，将暴露后的胚胎取出后，于荧光倒置显微镜下观察，并采集图像进行分析。


2.根据权利要求1所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，所述的huc：eGFP转基因斑马鱼胚胎的获取方法包括如下步骤：
S1：将huc：eGFP转基因斑马鱼成鱼饲养于鱼缸中，雌鱼和雄鱼要分开养殖，其养殖条件均一样：水温为28℃，光照周期为14h光照，10h黑暗，养殖密度为5-8尾/L，每天中、晚各喂食一次虾；
S2：每天第二次喂食结束后30min后进行配鱼，鱼缸盛水量为鱼缸体积的三分之二，每个鱼缸中为两雌一雄或一雌一雄，鱼缸中间用隔板将雌雄分开，次日光照开启时抽去隔板，13～20min雌鱼开始排卵，在30～40min时收集胚胎，去除死卵、粪便和其它杂物，用E3培养基洗涤数次，转移到28.5℃恒温培养箱中待用。


3.根据权利要求2所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，所述的E3培养基中，各组分的浓度为：5mMNaCl，0.17mMKCl，0.33mMCaCl2·2H2O，0.33mMMgSO4·7H2O；溶剂为水，pH为7.2～7.4。


4.根据权利要求1所述的废水的发育神经毒性评估方法，其特征在于，将废水预处理后得到待检测的废水，所述的预处理包括：(1)调节pH；(2)过滤杂质；(3)将野生型斑马鱼胚胎暴露于废水中，记录胚胎死亡情况，根据胚胎死亡情况评估结果，对废水进行浓缩或稀释至0％＜致死率≤20％。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴兵，陈玲，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32