采用时间相关的单光子计数的荧光寿命-显微-方法技术

本发明专利技术涉及一种采用时间相关的单光子计数的荧光寿命‑显微方法，其中，借助脉冲式光源(2)利用激发光脉冲周期性地激发样本(13)发出荧光光子，其中，在每两个相继的激发光脉冲之间确定测量区间，借助探测器(16)检测所述荧光光子，并且产生表示所检测的荧光光子的探测信号(17)，基于所述探测信号(17)来确定探测时间，对于所述探测时间，在相应的测量区间内由所述探测器(16)探测所述荧光光子，基于所述探测时间进行成像。为了在避免堆积‑效应的情况下以比较小的技术代价提高激发光强度，并且为了广泛地使用各种类型的探测器和电子机构，在所述荧光寿命‑显微方法中，在相应的测量区间内确定是否在所述测量区间内已检测到了预定数量的荧光光子。把所有检测到的光子的探测时间都汇总在对于多个图像像素而言共同的第一数据存储器中。仅把已在相应的测量区间内以预定数量检测到的荧光光子的探测时间汇总在对于所述多个图像像素而言共同的第二数据存储器中。在计算步骤中把汇总在所述第一数据存储器中的探测时间与汇总在所述第二数据存储器中的探测时间组合起来。把所述计算步骤的结果存储在第三数据存储器中。本发明专利技术还涉及一种用来实施这种荧光寿命‑显微方法的显微镜。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】采用时间相关的单光子计数的荧光寿命-显微-方法
本专利技术涉及一种根据权利要求1的前序部分的用于在时间相关地单光子计数时数字地矫正数据的荧光寿命-显微-方法以及一种根据权利要求14的前序部分的用于实施这种方法的显微镜。
技术介绍
荧光寿命-显微-方法，简写为FLIM(“fluorescencelifetimeimagingmicroscopy(荧光寿命成像显微)”)，是一种荧光显微的成像方法，其基于测量荧光分子的激发状态的不同的寿命。借助测得的寿命例如可以推断出荧光分子的环境特性，比如pH-值、温度、离子浓度、FRET-转移等，其中，FRET表示“-Resonanzenergietransfer(福斯特共振能量转移)”。确定荧光寿命可以直接在时域内进行(“时域寿命测量”)，或者在替代的方法中在频域内进行(“频域寿命测量”)。在时域内的确定可以采用所谓的时间相关的单光子计数—简写为TCSPC(“timecorrelatedsinglephotoncounting(时间相关的单光子计数)”)—的方法。在这种方法中，通过利用激发光脉冲周期性地激发而释放出来的光子逐个地予以检测。通常测量在激发光脉冲与其随后的被探测器检测到的荧光信号之间的时间。如此检测到的荧光光子随后通过多次测量被汇总在直方图中。在这种直方图中，与所测时间对应地绘出光子数。根据在样本中存在的荧光分子，会观察到具有一个或多个指数分量的荧光强度随时间减小。在这种方法中，时间测量通常以纳秒以下的分辨率来进行。在该时域内的时间测量时，因设备组件比如光源、光学机构、探测器和电子机构所致的误差影响很重要。通过设备而产生的全部误差称为设备传递函数，简写为IRF(“instrumentresponsefunction(设备响应函数)”)。设备传递函数可以在最佳的记录条件下测得。由待检查的样本本身的照片的数据确定设备传递函数也是常见的。对所记录的数据的分析通常采用非线性优化方法，使用如下形式的建模函数来进行：其具有荧光组分的数量N、各种组分的幅度An、各种组分的寿命τn、背景B和设备传递函数IRF(t)。采用优化方法可以确定寿命τn和相关的幅度An。所确定的寿命τn的精度在很大程度上取决于所吸收的光子数量。例如，为了以10％的测量精度确定一种组分的寿命τn，目前需要数100个光子。对于两种组分则大约需要10000个光子。为了能够在适当的时间内检查具有多种组分的样本，通常把全部图像像素或一个区域的图像像素的直方图汇总成一个在此称为总直方图(“overalldecay(整体衰减)”)的直方图。采用基于总直方图的优化方法以足够的精度提供了寿命τn和幅度An。结果通常随后在第二步骤中采用优化算法应用于各个图像像素，其中，只需以足够的精度确定建模函数的选定的参数，例如只需确定一种组分的幅度An或寿命τn。基于单光子计数的前述方法的问题在于，探测器和电子机构的组合在检测一个单光子之后在一定的时段内并未随即又准备好检测另一个光子。该时段也称为系统的死区时间。系统死区时间的影响无法在设备传递函数IRF(t)中予以考虑，因为这些影响取决于样本本身。常见系统的通常的死区时间处于大约50～100ns的范围内，而通过电子机构和探测器的技术进步，目前也开发出了死区时间在数纳秒范围内的系统。对于死区时间大于激发光脉冲周期的系统，通常只能探测到在激发光脉冲之后的第一荧光光子。在直方图中较小的时间分量出现较大的加权。使得测量结果失真的这种较大的加权在本领域中也称为堆积-效应。为了避免这种堆积-效应，必须把入射的激发光脉冲的强度调节得很低，致使相应长的记录时间导致本方法的应用性明显受限。即便对于死区时间在数纳秒范围内的系统，所记录的数据也会出现失真。相比于在晚些的时间点，在激发光脉冲之后，分子随即发出明显多的光子。这些光子的绝大部分始终都在死区时间内射到探测器上。这种系统虽然允许在通常的设备的测量误差相仿的情况下提高入射的激发光脉冲的强度，但不足以达到其它显微方法的记录时间。通过很大程度上并行化探测器和电子机构，可以大大减小死区时间效应。然而，这种并行化在技术上很麻烦，因此牵涉到显著的成本。因而在采用荧光寿命-显微术时，矫正死区时间效应对于很多应用来说非常重要。由该文献已知有很多种用于在时间相关地单光子计数时矫正死区时间效应的方法。所有这些方法都在其应用到总直方图上具有局限性，或者在选择可用的探测器类型或电子机构时具有局限性。这些方法可以分成三组：对探测器的信号予以滤波的方法、对直方图-数据予以修改的方法和对优化方法本身进行改变的方法。除了正确的数据分析方面外，针对用户的数据表示也很重要。用户可以由图形表示推断出记录结果和其它必要的活动。因此希望以校正的形式表示总直方图。在WO2017/201980中记载了一种方法，其中，只考虑激发光脉冲的周期，其中在彼此相继的激发光脉冲之间检测规定数量的光子。如果探测器和电子机构满足一些前提条件，则该方法可以用于产生矫正的总直方图。对于不同的光子，信号宽度不许差别明显，必须可以识别出多个短的彼此相继的光子信号，并且电子机构必须具有针对脉冲宽度的能实现这种滤波的分析方法。该方法因而不能广泛地应用。在P.B.Coates的“Pile-upcorrectionsinthemeasurementoflifetimes”,J.Phys.E:Sci.Instrum.5,148-150(1972)中记载了一种方法，其中，直方图中的指配给相应的探测时间的每一列都独立于其它列予以修改。该修改基于光子探测的统计特性。该方法不能应用于总直方图，因为总直方图由不同样本位置处的数据组成，这些样本位置相应地具有不同的强度。由于各个直方图中的光子数量太少，组装前的矫正失败。在J.G.Walker的“Iterativecorrectionfor‘pile-up’insingle-photonlifetimemeasurement”,Opt.Comm.,201,271-277(2002)中记载了一种细化的方法，其采用迭代方案附加地考虑光源的强度波动。在如今通常采用脉冲式激光光源情况下，强度波动不再是相关的误差源。但这种构思也可以应用于考虑在不同图像像素中的汇总在总直方图中的不同的强度。但在此，这种迭代方法实际上通常不会收敛，因为强度可能相差太大。在M.Patting等人的“Dead-timeeffectsinTCSPCdataanalysis”,Proc.ofSPIEVol.6583,658307,(2007)中记载了一种方法，其中，对优化方法的建模函数予以调整，以便考虑死区时间效应。该方法也可以在省去那里介绍的简化情况下应用于由具有很小死区时间的系统产生的数据。在修改的建模函数fm(t)中，上述建模函数f(t)乘以一个矫正项，该矫正项相当于在死区时间内未探测到光子的概率。P是激发光脉冲的数量，td是系统的死区时间。该方法适合于采用优化方法来确定各个图像像素中的所搜索的参数。无法应用于总直本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用时间相关的单光子计数的荧光寿命-显微方法，其中，/n借助脉冲式光源(2)利用激发光脉冲周期性地激发样本(13)发出荧光光子，其中，在每两个相继的激发光脉冲之间确定测量区间，/n借助探测器(16)检测所述荧光光子，并且产生表示所检测的荧光光子的探测信号(17)，/n基于所述探测信号(17)来确定探测时间，对于所述探测时间，在相应的测量区间内由所述探测器(16)探测所述荧光光子，/n基于所述探测时间进行成像，/n其特征在于，在相应的测量区间内确定是否在所述测量区间内已检测到了预定数量的荧光光子，/n把所有检测到的荧光光子的探测时间都汇总在对于多个图像像素而言共同的第一数据存储器中，/n仅把已在相应的测量区间内以预定数量检测到的荧光光子的探测时间汇总在对于所述多个图像像素而言共同的第二数据存储器中，/n在计算步骤中把汇总在所述第一数据存储器中的探测时间与汇总在所述第二数据存储器中的探测时间组合起来，/n并且把所述计算步骤的结果存储在第三数据存储器中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180216 DE 102018103576.41.一种采用时间相关的单光子计数的荧光寿命-显微方法，其中，
借助脉冲式光源(2)利用激发光脉冲周期性地激发样本(13)发出荧光光子，其中，在每两个相继的激发光脉冲之间确定测量区间，
借助探测器(16)检测所述荧光光子，并且产生表示所检测的荧光光子的探测信号(17)，
基于所述探测信号(17)来确定探测时间，对于所述探测时间，在相应的测量区间内由所述探测器(16)探测所述荧光光子，
基于所述探测时间进行成像，
其特征在于，在相应的测量区间内确定是否在所述测量区间内已检测到了预定数量的荧光光子，
把所有检测到的荧光光子的探测时间都汇总在对于多个图像像素而言共同的第一数据存储器中，
仅把已在相应的测量区间内以预定数量检测到的荧光光子的探测时间汇总在对于所述多个图像像素而言共同的第二数据存储器中，
在计算步骤中把汇总在所述第一数据存储器中的探测时间与汇总在所述第二数据存储器中的探测时间组合起来，
并且把所述计算步骤的结果存储在第三数据存储器中。


2.如权利要求1所述的荧光寿命-显微方法，其特征在于，以第一直方图的形式求取汇总在所述第一数据存储器中的探测时间，该第一直方图表示未矫正的总直方图，
以第二直方图的形式求取汇总在所述第二数据存储器中的探测时间，该第二直方图表示所述第一直方图的子集，并且，
以第三直方图的形式求取所述计算步骤的存储在所述第三数据存储器中的结果，该第三直方图表示矫正的总直方图。


3.如权利要求2所述的荧光寿命-显微方法，其特征在于，所述矫正的总直方图是无死区时间地被记录的理想的直方图。


4.如前述权利要求中任一项所述的荧光寿命-显微方法，其特征在于，所述预定数量等于1。


5.如权利要求2～4中任一项所述的荧光寿命-显微方法，其特征在于，在所述计算步骤中把所述第一直方图的列与所述第二直方图的列—这些列指配给与所述第一直方图的前述列不同的探测时间—组合起来。


6.如前述权利要求中任一项所述的荧光寿命-显微方法，其特征在于，以数据流的形式产生探测信号，在该数据流中针对每个检测的荧光光子都嵌入数据字。


7.如权利要求6所述的荧光寿命-显微方法，其特征在于，在所述数据字...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰克·赫克特，伯纳德·韦兹戈夫斯基，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE