修饰的滤膜和方法技术

实施方案提供了用于分离生物产品和病毒污染物的粗溶液的修饰的滤膜。所述滤膜具有纤维素基多孔表面，以及结合至所述滤膜的纤维素基多孔表面的至少一种二价金属离子，以形成修饰的滤膜纤维素基多孔表面，其中所述修饰的纤维素基多孔表面通过截留直径大于15nm的病毒污染物同时允许直径小于15nm的生物产品通过来分离粗溶液。实施方案还提供了一种方法，该方法使用修饰的滤膜过滤生物产品和病毒污染物的粗溶液，所述方法通过将二价金属离子添加到滤膜多孔表面上形成具有孔径的尺寸在1至15nm范围内的修饰的滤膜多孔表面，并通过修饰的滤膜的多孔表面过滤生物产品和病毒污染物的粗溶液，其中所述修饰的滤膜将病毒污染物截留在多孔表面上，同时允许生物产品通过。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的滤膜和方法
技术介绍
已经设计了各种过滤器和方法以将生物分子与杂质或污染物分离。基于尺寸排阻的过滤是一种理想的且有效的技术，用于从生物制造过程的生物反应器中清除源自哺乳动物细胞、血浆、动物/人类组织液或细胞培养液的小颗粒和病毒。当前的过滤技术可以清除各种污染物和直径超过15nm的病毒颗粒。然而，迄今为止，尚不存在有效或强大地清除小于该尺寸的颗粒和组织液的技术或过滤器。例如，小病毒和非包膜病毒(例如细小病毒和圆环病毒)很难从生物溶液中清除。这些小颗粒、病毒和痕量污染物会在生物制剂生产中引起问题，因为它们可以通过细胞培养和/或生产制造周期进行扩增。此外，当粗溶液或条件变化并且蛋白质分子大小较大且蛋白质浓度非常低时，通过病毒过滤器和方法很难获得高且一致的生物产品回收率。这些和其他问题已由本实施方案解决。专利技术概述实施方案提供了修饰的滤膜，用于清除小颗粒和其他未知或未鉴定的污染物，例如存在于粗溶液中的，需要将其与目标生物产品分离的病毒。实施方案还提供了用于分离生物产品和病毒污染物的粗溶液的修饰的滤膜，其包括具有纤维素基多孔表面的滤膜，和至少一种二价金属离子结合在滤膜的纤维素基多孔表面上，以形成修饰的滤膜纤维素基多孔表面，其中所述修饰的纤维素基多孔表面通过截留直径大于15nm的病毒污染物同时允许直径小于15nm的生物产品通过来分离粗溶液。实施方式还提供了使用修饰的滤膜过滤生物产品和病毒污染物的粗溶液的方法，包括在滤膜多孔表面上加入二价金属离子以形成孔径在1至15nm范围内的修饰的滤膜多孔表面；以及通过修饰的滤膜的多孔表面过滤生物产品和病毒污染物的粗溶液，其中修饰的滤膜将病毒污染物截留在多孔表面上，同时允许生物产品通过。其他实施方案可任选地包括添加吐温80，以进一步增强滤膜分离的组合物和方法，并增加从粗溶液中分离的生物产品的产率。附图简述本领域技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导或权利要求的范围。图1显示了使用病毒滤膜(例如PlanovaTM20N)的过滤系统。经由压力源(例如压缩空气或蠕动泵)将过滤器负载材料施加到再生的硝酸纤维素中空纤维膜上。滤液收集在收集容器中。图2显示了未修饰的病毒滤膜的多孔表面的增强部分。图3显示了用于二价金属离子增强的病毒过滤的方法。图4显示了二价金属离子纤维素基的过滤器的各种提出的机理。图5显示了在负载中存在CaCl2时，用病毒滤膜可增强掺入的PPV的清除。(A)过滤缓冲液为20mM咪唑，300mMNaCl，43mMCaCl2，pH＝6.9-7.1。(B)过滤缓冲液为20mM咪唑，375mMNaCl，pH＝6.9-7.1。A和B均在环境温度恒定压力(12-14PSI)下进行。图6显示，吐温80的存在和过滤温度对病毒滤膜清除掺入的PPV的影响不大。(C)在环境温度(15-26℃)用20mM咪唑、300mMNaCl、43mMCaCl2、50ppm吐温80过滤，pH＝6.9-7.1。(D)在2-8℃用20mM咪唑、300mMNaCl、43mMCaCl2、50ppm吐温80过滤，pH＝6.9-7.1。(E)在室温用20mM咪唑、300mMNaCl、43mMCaCl2过滤，pH＝6.9-7.1。(F)在2-8℃用20mM咪唑、300mMNaCl、43mMCaCl2过滤，pH＝6.9-7.1。图7显示不同的缓冲液系统的选择对病毒滤膜对掺入的PPV的清除没有显著影响。(G)在室温用20mM咪唑，300mMNaCl，43mMCaCl2过滤，pH＝6.9-7.1。(H)在室温用20mMTris，300mMNaCl，43mMCaCl2过滤，pH＝6.9-7.1。(I)在室温用50mMTris，50mMNaCl过滤，pH＝6.9-7.1。(J)在室温用50mM柠檬酸，50mMNaCl过滤，pH＝6.6-6.8.图8显示了在不同的CaCl2浓度下用病毒滤膜从掺入PPV的IgG2抗体负载中(在50mMTris、50mMNaCl中为5.7-8.1mg/mL，pH6.9-7.1)清除病毒作用的增强，以及EDTA螯合剂对增强作用的逆转。图9显示了在不同的CaCl2浓度下用病毒滤膜从掺入PPV的IgG1抗体负载中(在50mM柠檬酸、50mMNaCl中为4.9-13.1mg/mL，pH6.6-6.8)清除病毒作用的增强，以及EGTA螯合剂对增强作用的无逆转。图10显示了用病毒滤膜从掺入PPV的rFVIII过程中间体(在20mM咪唑、300mMNaCl、43mMCaCl2、50ppm吐温80中约0.1mg/mL，pH＝6.9-7.1)中完全清除PPV(至低于检测极限)。图11显示了当使用病毒滤膜时，吐温80对重组人因子VIII的产率一致性的改善。图12显示了在施加重组人因子VIII负载的情况下吐温80对病毒滤膜容量(VMax)的增强。专利技术详述本公开内容提供了用于从溶液中清除小颗粒和病毒污染物的组成物，包括修饰的滤膜。定义为了解释本说明书，将采用以下定义。如果以下列出的任何定义与任何其他文件(包括通过引用并入本文的任何文件)中该词的用法相冲突，除非明确指出相反的含义(例如，在最初使用该术语的文档中)，否则应始终以下文中列出的定义为准来解释本说明书及其相关权利要求。只要适当，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。除非另有说明，或者在使用“一个或多个”显然不合适的情况下，本文中“一个”的使用表示“一个或多个”。除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。“包含”，“包括”和“含有”的使用是可互换的，而不是限制性的。术语“如”和“例如”也并非是限制性的。例如，术语“包括”应表示“包括但不限于”。如本文所用，术语“粗溶液”或“粗负载”通常是指包含一种或多种生物材料或分子的未加工或未纯化的溶液或材料。在此溶液或材料中还可能存在一种或多种先前可能已经识别或可能尚未识别的污染物。例如，病毒可能是“粗溶液”中存在的一种污染物。还可以预期，“粗溶液”还包含可能存在或希望与目标生物产品分离的其他病原体和污染物。如本文所用，术语“约”是指所提供的单位值的+/-10％。如本文所用，术语“基本上”是指表现出所关注的特征或特性的总体或近似程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，由于许多影响生物产品、化学成分和材料的测试、生产和储存的变量，并且由于用于测试、生产和储存生物产品和化学成分及材料的仪器和设备存在固有误差，生物产品和化学现象很少(如果有的话)获得或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于表达许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。过滤系统：所描述的实施方案可以多种方式修改和改变。所描述的系统绝不应限制可能的应用和实施方案的范围。参考图1，本实施方案的过滤系统10提供入口20或20'，关闭的出口30，开放的出口40，滤膜例如PlanovaTM20N病毒过滤器50，以及至少一个收集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于分离生物产品和病毒污染物的粗溶液的修饰的滤膜，其包括：/n(a)具有纤维素基多孔表面的滤膜；和/n(b)结合到滤膜的纤维素基多孔表面上的至少一种二价金属离子，形成修饰的滤膜纤维素基多孔表面，/n其中所述修饰的纤维素基多孔表面通过截留直径大于15nm的病毒污染物同时允许直径小于15nm的生物产品通过来分离粗溶液。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180219 US 62/632,1651.用于分离生物产品和病毒污染物的粗溶液的修饰的滤膜，其包括：
(a)具有纤维素基多孔表面的滤膜；和
(b)结合到滤膜的纤维素基多孔表面上的至少一种二价金属离子，形成修饰的滤膜纤维素基多孔表面，
其中所述修饰的纤维素基多孔表面通过截留直径大于15nm的病毒污染物同时允许直径小于15nm的生物产品通过来分离粗溶液。


2.根据权利要求1所述的修饰的滤膜，其中所述二价金属离子选自Cu2+、Ca2+和Zn2+。


3.根据权利要求2所述的修饰的滤膜，其中，所述病毒污染物包括非包膜的病毒颗粒或病毒。


4.根据权利要求3所述的修饰的滤膜，其中，所述病毒污染物包括15-25nm范围内的细小病毒或环状病毒。


5.根据权利要求3所述的修饰的滤膜，其中，所述病毒污染物还包括选自环病毒科、腺病毒科、细小病毒科、乳多空病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科和指环病毒科的DNA病毒。


6.根据权利要求3所述的修饰的滤膜，其中，所述病毒污染物还包括RNA病毒，该RNA病毒选自小RNA病毒科、杯状病毒科、呼肠孤病毒科、披膜病毒科、沙粒病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科、正粘液病毒科、副粘液病毒科、纤丝病毒科、冠状病毒科、动脉炎病毒科、肝炎病毒科和逆转录病毒科。


7.根据权利要求1所述的修饰的滤膜，其中所述粗溶液包括蛋白质溶液。


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【专利技术属性】
技术研发人员：S刘，W王，A赫斯莱恩，
申请(专利权)人：拜耳医药保健有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US