一种丝瓜内参基因EF-1α及其引物和应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种丝瓜内参基因

【技术实现步骤摘要】
一种丝瓜内参基因EF-1α及其引物和应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种丝瓜内参基因EF-1α及其引物和应用。
技术介绍
丝瓜(Luffacylindrica.L)是中国重要的夏季蔬菜之一，具有营养价值高、适应性广、耐热、耐湿、抗逆性强等优点，同时兼具药用功能，因此，种植丝瓜具有很大的商业价值和巨大的市场潜力。然而，在栽培过程中丝瓜植株时常会受到多种逆境胁迫的影响。因此，提高植株自身对逆境胁迫的抗逆性是丝瓜育种工作的重要目标之一。随着分子生物学研究的不断发展，功能基因研究已成为植物抗逆育种的重要手段，基因表达分析则是植物功能基因研究的基础。为了避免不同样本初始模板量、RNA提取、酶促反应等背景误差，通常在基因表达分析中需要利用内参基因进行数据校正和标准化。理想的内参基因应该在不同组织类型、不同生长阶段及不同环境条件下保持表达水平恒定。然而，近来的研究表明，适用于所有不同试验条件的内参基因并不存在。若只选取一种内参基因作为通用的内参基因，可能造成定量不准确甚至出现错误的实验结果。因此，根据实验条件和实验材料筛选合适的内参基因，已成为应用实时荧光定量PCR进行基因组功能分析的重要前提。目前，丝瓜的内参基因仅有18SrRNA基因，其它内参基因的克隆及内参基因稳定性筛选的研究未见报道，因此，在丝瓜逆境胁迫基因表达研究中尚缺合适的内参基因。本专利技术通过从丝瓜转录组数据获得内参基因EF-1α，利用BestKeeper，GeNorm，NormFinder和RefFinder分析软件和DeltaCt法对该基因的稳定性进行评价，表明该基因适用于丝瓜高温、低温和ABA胁迫下基因表达研究，并用该基因为基础设计了实时荧光定量PCR引物，为后续丝瓜功能基因的精确定量及功能研究奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供适用于丝瓜高温、低温和ABA胁迫下，用于基因表达研究的一种丝瓜内参基因EF-1α及其引物和应用。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种丝瓜内参基因EF-1α，所述内参基因EF-1α的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；该内参基因是在分析丝瓜转录组数据基础上，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；其中引物序列为：正向引物5'-ATGGGTAAGGAAAAGATTCACATC-3'，反向引物5'-TTATTTCTTCTTGACAGCGGACTT-3'。进一步地，以所述内参基因EF-1α的核苷酸序列为基础，利用PrimerPremier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；具体引物序列为：正向引物5'-TCAAGAAGGTCGGATACA-3'，反向引物5'-ACAGGGACAGTTCCAATAC-3'。进一步地，利用所述实时荧光定量PCR引物，采用BestKeeper，GeNorm，NormFinder和RefFinder分析软件和DeltaCt法对EF-1α基因的稳定性进行评价，表明EF-1α基因在高温、低温和ABA胁迫条件下最稳定，可以作为研究丝瓜高温、低温和ABA胁迫条件下基因表达的内参基因。本专利技术有益效果在于：本专利技术公开了一种适用于丝瓜高温、低温和ABA胁迫下，基因表达研究的内参基因EF-1α，同时揭露了利用该丝瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物及其应用。本专利技术的内参基因可在丝瓜响应高温、低温和ABA胁迫时稳定表达，所设计的实时荧光定量PCR引物用于丝瓜响应高温、低温和ABA胁迫时的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的描述。图1是本专利技术中实施例1的1%琼脂糖凝胶电泳图。图2是本专利技术中实施例2的1%琼脂糖凝胶电泳图。图3是本专利技术中实施例2的溶解曲线图。具体实施方式实施例1丝瓜内参基因EF-1α获得（1）从丝瓜转录组数据中获得内参基因EF-1α，采用PrimerPremier5.0设计一对引物，且由铂尚生物技术(上海)有限公司合成该对引物，该对引物为：正向引物5'-ATGGGTAAGGAAAAGATTCACATC-3'，反向引物5'-TTATTTCTTCTTGACAGCGGACTT-3'。（2）总RNA提取和cDNA第1链的合成：采用通用植物RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取丝瓜叶片的总RNA。使用ThermoNanoDrop2000C（ThermoScientific）测定总RNA浓度和纯度，选择在260/280nm处的吸光度比为1.8-2.0左右的RNA样品。通过1％琼脂糖凝胶电泳评估总RNA完整性。依据PrimeScriptII第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链，–20℃冰箱保存备用。（3）PCR扩增：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。PCR反应体系：反应总体积为25μL，包括T3SuperPCRMix12.5μL、正向引物（0.4μmol·L-1）1μL、反向引物（0.4μmol·L-1）1μL、模板cDNA（100ng）2μL和ddH208.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃下延伸10min；于4℃下保存。（4）取步骤（3）所得PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到如图1所示大小的片段，回收该片段并进行纯化后连接到pMD18-T载体上转化，挑取阳性克隆子，PCR检测后送至测序，所测得的序列即为内参基因的核苷酸序列，其如SEQIDNO：1所示。实施例2引物设计和特异性检测（1）以实施例1获得的内参基因的核苷酸序列为基础，利用PrimerPremier5.0软件，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为223bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物（如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示）：正向引物5'-TCAAGAAGGTCGGATACA-3'，反向引物5'-ACAGGGACAGTTCCAATAC-3'。（2）采用通用植物RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取丝瓜叶片的总RNA。依据PrimeScriptII第1链cDNA合成试剂盒（Takara）使用说明合成cDNA第1链，–20℃冰箱保存备用。（3）常规PCR检测：以经步骤（2）处理所得的cDNA为模板，并以步骤（1）中获得的引物进行常规PCR扩增反应，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：PCR反应体系：反应总体积为25μL，包括T3SuperPCRMix12.5μL、正向引物（0.4μmol·L-1）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丝瓜内参基因

【技术特征摘要】
1.一种丝瓜内参基因EF-1α，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；且该内参基因是在分析丝瓜转录组数据基础上，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得；其中引物序列为：
正向引物5'-ATGGGTAAGGAAAAGATTCACATC-3'，
反向引物5'-TTATTTCTTCTTGACAGCGGACTT-3'。


2.一种丝瓜内参基因EF-1α的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：以权利要求1中所述内参基因的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏氡，王彬，朱海生，李永平，温庆放，刘建汀，叶新如，曾美娟，裘波音，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35