用于借助光片显微镜对样本成像的方法技术

介绍一种用于借助光片显微镜(10)对样本成像的方法。其中，利用两个光片(58、60)从两个不同的照明方向对所述样本照明，这些光片具有不同的偏振状态，并且在所述样本的目标区域(E)中彼此共面地重叠。借助所述光片显微镜(10)的成像光学机构(14)产生被照明的所述目标区域(E)的图像。利用两个所述光片(58、60)在被照明的所述目标区域(E)中产生干涉图案(I)，由此对所述目标区域(E)的图像施加与所述干涉图案(I)相应的图像调制。分析所述图像调制。根据所分析的所述图像调制，相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)来调节被照明的所述目标区域(E)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于借助光片显微镜对样本成像的方法
本专利技术涉及一种用于借助光片显微镜对样本成像的方法，其中，利用两个光片从两个不同的照明方向对样本照明，并且借助光片显微镜的成像光学机构产生被照明的目标区域的图像，这些光片具有不同的偏振状态，并且在样本的目标区域中彼此共面地重叠。本专利技术还涉及一种相应地工作的光片显微镜。
技术介绍
在所谓的光片或光板显微术中，通过照明光学机构利用薄光片对样本的目标区域予以照明，并借助成像光学机构对被如此照明的目标区域予以成像，该成像光学机构的光轴垂直于照明光学机构的光轴。通过使得理想地与成像光学机构的清晰区域叠合的、利用光片予以照明的目标区域连续地沿着成像光学机构的光轴移动经过样本，可以实现三维的成像。在宽视野-荧光显微术中采用的这种方法的优点尤其也是样本的光负荷特别小。但问题是，照明光垂直于成像光学机构的光轴传播。因而会因样本内部的散射中心或吸收体而使得照明光出现散射或吸收，这在所产生的图像中沿照明光的传播方向以条纹伪像的形式能发觉到。为了减小这种伪像，在专利DE102016108384B3中提出，并非仅用一个光片，而是用两个光片对样本的目标区域照明，这些光片从同一侧，但从不同的照明方向，朝向目标区域，并在那里彼此共面地即在一个共同的照明平面中重叠。这种光片照明的实现方式为，使得照明光束穿过Wollaston-棱镜，该棱镜把照明光束分成两个不同地线性偏振的分光束，这些分光束偏转离开照明光路的光轴，因而从不同的照明方向进入到照明平面中，即进入到样本的目标区域中。现在如果在两个照明方向之一上因散射中心或吸收体而出现照明光遮暗，则通过未受散射中心或吸收体影响的另一个照明方向始终都确保对目标区域的充分的光片照明。为了保证在光片显微镜中尽量清晰的成像，在照明平面即由光片厚度确定的目标区域与焦点平面即成像光学机构的由清晰深度确定的清晰区域之间需要有精确的空间上的交叠。在现有技术中，大多通过视觉上的评估，例如使用具有小荧光粒子的参考标本，进行为此所需要的、下面称为交叠调节的细微调节，通过该细微调节在被照明的目标区域与成像光学机构的清晰区域之间产生空间上的重叠。也可以在视觉上评估被显微地摄像的样本图像本身，以便进行交叠调节。但这种做法只能实现比较粗略的交叠调节。特别地，引入参考标本并不反映真实的成像状况，在真实的成像状况中，由于折射率错误调整例如因样本引起出现像差。相比之下，一种比较麻烦的调节方法规定，将一个反射镜引入到照明光路中，一旦进行调节，该反射镜就使得光片偏转到在成像光路的图像平面中布置的探测器的参考位置。所有前述方法的共同之处是，它们不能实现自动的交叠调节。这里要考虑到，基于对样本图像清晰度的自动分析的调节牵涉到如下困难：待成像的样本的由样本图像的傅里叶变换产生的空间频谱通常是未知的。这尤其意味着，事先不了解样本的空间频谱到底是否具有高的空间频率，所述空间频率归因于微小的进而适合于调节的样本结构。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提出一种用于借助光片显微镜对样本成像的方法以及一种光片显微镜本身，它们能实现精确地且自动地调节在样本的被照明的目标区域与成像光学机构的清晰区域之间的空间上的重叠。本专利技术通过独立权利要求的主题来实现该目的。有利的改进在从属权利要求中给出。本专利技术规定了一种用于借助光片显微镜对样本成像的方法，其中，利用两个光片从两个不同的照明方向对样本照明，并且借助光片显微镜的成像光学机构产生被照明的目标区域的图像，这些光片具有不同的偏振状态，并且在样本的目标区域中彼此共面地重叠。利用两个光片在被照明的目标区域中产生干涉图案，由此对目标区域的图像施加与干涉图案相应的图像调制。分析图像调制，并且根据所分析的图像调制，相对于成像光学机构的清晰区域来调节被照明的目标区域。本专利技术规定相对于成像光学机构的清晰区域自动地调节被照明的目标区域，其方式为，针对图像调制来分析目标区域的通过成像光学机构摄取的图像。通过利用两个干涉的光片对成像的目标区域予以照明，对图像施加图像调制。通过这种方式，产生了对目标区域照明的干涉图案，该干涉图案以前述的图像调制的形式反映在被照明的目标区域的图像中，该图像调制例如被为此设置在光片显微镜中的控制单元予以分析，并且被用于自动的交叠调节。例如当给被照明的目标区域的图像施加的图像调制最大时，调节结束。图像中存在的调制因而在很大程度上取决于被施加以光片照明的目标区域和成像光学机构的清晰区域在空间上彼此重叠的精确度有多大。简单地说，当通过两个光片共同地规定的照明平面与成像光学机构的焦点平面叠合时，图像调制最大。为了交叠调节，要保证两个光片在被照明的目标区域中相互干涉。因而要这样产生这些光片：使得它们具有对于干涉来说足够的在时间和空间上的彼此相关度。此外，特别是要保证两个光片在调节期间具有完全能实现使得这些光片在目标区域中干涉的偏振状态。如果例如认为两个光片从一开始就不同地线性偏振，则这些光片在它们的偏振方向并非彼此正交时在目标区域中相互干涉。只要保证了这一点，就不需要专门被设置用于通过影响两个光片的偏振状态来确保这些光片的在目标区域中的干涉能力的偏振器件。这种专门被设置用于产生各光片的干涉能力的偏振器件却可以按有利的方式用来通过相应地影响偏振状态而在目标区域中产生特别显眼的干涉图案。例如，偏振器件可以用于使得两个光片平行地线性偏振，由此使得两个光片的干涉最大。这种偏振器件例如可以通过在照明光路中安置在合适位置的双折射晶体来实现，或者通过其它类型的偏振器比如延迟板来实现。同样可以通过照明光学器件的与偏振有关的特性来实现对光片偏振状态的影响，其方式为，例如使用干涉层的与偏振有关的相，或者使用应力双折射的器件。此外，可使用电光学的器件或基于液晶工作的器件。优选地，分析图像调制，其方式为，确定图像调制的幅度。于是相对于成像光学机构的清晰区域调节被照明的目标区域，使得图像调制的幅度最大。由此，图像调制的幅度形成了能以简单的方式检测的优化参数，基于该优化参数可以在光片显微镜中进行自动的交叠调节。在一种有利的实施方式中，规定干涉图案的特征并且借助该规定的特征来分析图像调制。前述特征是干涉图案的特性，该特性例如可以由光片照明的所选造型导出，进而是预先已知的。干涉图案的这种已知的特性于是可以按简单的方式被考虑用于分析图像调制。例如，干涉图案以条纹图案的形式产生，该条纹图案的干涉条纹平行于由两个光片的照明方向相互夹成的角度的角平分线伸展，其中，条纹图案按如下关系式以调制周期为特点：f＝λsin(α/2)。其中，f是调制周期，λ是光片的波长，α是那些照明方向相互夹成的前述角度。在这个例子中，调制周期f是干涉图案的从一开始就已知的特征，该特征由这些光片的规定的波长λ以及由在两个光片的两个照明方向之间的同样规定的角度α产生。除了调制周期外，干涉图案的方向由光片照明的造型即两个光片的照明方向也是已知的。由于了解调制周期和干涉图案的方向，所以现在可以例如通过对图像的傅里叶-分析而简单且可靠地确定图像调制的幅度。在通过傅里叶-分析而产生的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于借助光片显微镜(10)对样本成像的方法，其中，/n利用两个光片(58、60)从两个不同的照明方向对所述样本照明，这些光片具有不同的偏振状态，并且在所述样本的目标区域(E)中彼此共面地重叠；并且，/n借助所述光片显微镜(10)的成像光学机构(14)产生被照明的所述目标区域(E)的图像，/n其特征在于，/n利用两个所述光片(58、60)在被照明的所述目标区域(E)中产生干涉图案(I)，由此对所述目标区域(E)的图像施加与所述干涉图案(I)相应的图像调制，/n分析所述图像调制，并且，/n根据所分析的所述图像调制，相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)来调节被照明的所述目标区域(E)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180201 DE 102018102241.71.一种用于借助光片显微镜(10)对样本成像的方法，其中，
利用两个光片(58、60)从两个不同的照明方向对所述样本照明，这些光片具有不同的偏振状态，并且在所述样本的目标区域(E)中彼此共面地重叠；并且，
借助所述光片显微镜(10)的成像光学机构(14)产生被照明的所述目标区域(E)的图像，
其特征在于，
利用两个所述光片(58、60)在被照明的所述目标区域(E)中产生干涉图案(I)，由此对所述目标区域(E)的图像施加与所述干涉图案(I)相应的图像调制，
分析所述图像调制，并且，
根据所分析的所述图像调制，相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)来调节被照明的所述目标区域(E)。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分析所述图像调制，其方式为，确定该图像调制的幅度，并且相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)，使得所述幅度最大。


3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，规定所述干涉图案(I)的特征，并且借助该规定的特征来分析所述图像调制。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述干涉图案(I)以条纹图案的形式产生，该条纹图案的干涉条纹平行于由两个所述光片(58、60)的照明方向相互夹成的角度的角平分线伸展，其中，所述条纹图案按如下关系式以调制周期为特点：f＝λsin(α/2)，其中，f是调制周期，λ是所述光片的波长，α是所述角度。


5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，分析所述图像调制，其方式为，对所述图像进行傅里叶-分析。


6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，为了相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)来调节被照明的所述目标区域(E)，使得两个彼此共面地重叠的所述光片(58、60)共同地沿着所述成像光学机构(14)的光轴(O')移动。


7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)之前，使得两个所述光片(58、60)过渡至能干涉的偏振状态下。


8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)之前，使得两个所述光片(58)彼此非正交地线性地偏振。


9.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：西奥·拉瑞欧，克里斯蒂安·舒曼，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE