本发明专利技术的实施方式提供了用于处理显微图像以能够对高密度原始数据进行定位分析并从而实现比另外的情况高的空间分辨率的方法和系统。这是通过利用因接近的发射体而产生的图像数据中的时间冗余来实现的，否则，如果接近的发射体同时发射或发荧光，则被分辨为单个发射体，但是由于在稍微不同(但可能交叠)的时间发射或发荧光，所以可以由不同时间带宽的不同滤波器对其进行时间滤波，以分辨两个发射体。有效地，不同时间滤波器具有不同时间常数，其共同起作用以有效地强调两个发射体的不同发射或发荧光时间，从而允许分离地分辨两个接近的发射体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于定位显微的方法和系统
本专利技术的实施方式涉及用于通过依次应用多个时间尺度滑动时间滤波器来处理定位显微图像序列以降低个体图像帧中观察到的发射体/荧光体的密度的方法和系统。密度降低允许将低密度数据分析方法和高密度数据分析方法随后应用于数据，而不会生成将这些方法应用于具有高密度发射体的数据时通常产生的图像伪影。
技术介绍
定位显微是用于获得超出衍射极限的图像分辨率(通常称为超分辨率)的光学显微中的技术。其涉及用显示荧光间歇或“闪烁”的荧光分子来化学地标记样本结构。荧光间歇可以通过添加化学物以及通过用适当强度和波长的光照射来控制。荧光标记样本结构和控制荧光发射间歇的手段基本落入两种类型中。随机光学重建显微(STORM)用荧光有机染料分子来标记样本。通常通过添加氧清除酶和化学还原剂来辅助荧光间歇。可光活化定位显微(PALM)使用荧光蛋白来标记结构，通过应用短波长可见/近紫外光(紫外光还可以重新激活STORM中的发射体/荧光体)，可以将该荧光蛋白从非发射状态切换成发射状态或从一种发射状态切换成较长波长的另一发射状态。当在典型的定位显微仪器中拍摄样本的图像时，该图像将由许多接近衍射极限大小的荧光“斑”组成。这些斑的大小定义了仪器点扩散函数(PSF)。各个斑都是由单个发射体/荧光体产生的，该发射体/荧光体自发地或有意地被切换成适当的发射状态。如果荧光斑被充分分离以使得它们彼此不交叠，则可以安全地假定只有单个活动发射体/荧光体对该斑有贡献。然后可以根据其荧光发射以远大于荧光斑大小的精度(通常为10nm至30nm的精度)确定发射体的位置。这是已知为定位的处理，并且总是由计算机软件中实现的算法执行。如果成功定位了足够数量的发射体/荧光体，则可以根据这些定位位置以高分辨率推断出样本结构。通常使用附接到常规宽视场荧光显微镜的高灵敏度(sCMOS/EMCCD)摄像头来拍摄发射体/荧光体发射的图像作为序列图像帧的长序列。在各个后续帧中，活动发射体/荧光体中的一些将切换出发射状态，并且一些其它先前非发射的发射体/荧光体将切换成发射。活动发射体/荧光体很好地被分离的这种需求将各个帧中的活动发射体/荧光体的数量限制在相对低的数量，从而通常需要成千上万个图像帧来准确地重建样本结构。所使用的摄像头速度的局限性意味着图像采集需要几分钟，时间过长以致于无法拍摄正在研究的结构的许多动态变化，诸如正常存在于活细胞样本中的动态变化。由以上概述表示的示例公开现有技术包括：(参考STORM)Rust,M.,Bates,M.,andZhuang,X.Sub-diffraction-limitimagingbystochasticopticalre-constructionmicroscopy(STORM).Nat.Methods3,793-796(2006)；(参考PALM)Betzig,E.etal.Imagingintracellularfluorescentproteinsatnanometerresolution.Science313,1642-1645(2006)；以及(参考PALM专利)WO/2006/127592Opticalmicroscopywithphototransformableopticallabels.Hess,HaroldF。通过增加各个图像帧中的活动发射体/荧光体的数量、减少用于准确重建所需的帧数，可以大大提高采集速度。然而，定位方法/算法必须能够应对个体发射体的荧光发射图案(斑)的实质交叠。活动发射体之间的典型距离小于PSF的实验方案称为高密度定位显微。当实现这种方案时，标准的单个发射体算法(诸如单个高斯拟合)将无法检测和/或准确定位各个发射体。另外，紧密分离的发射体/荧光体的拟合位置包含朝向共同中心的偏差。这导致重建的超分辨率图像中的大量伪影，诸如人工锐化、错误的聚集和缺失的结构。人工锐化尤其成问题，因为给出高分辨率的错误印象，即使是通过诸如傅立叶环相关性(FRC)的度量进行的测量。当前没有方法可以检测定位显微重建中的这些伪影的存在。由于很少了解所检查的样本的基本真实结构，因此这些伪影很容易被误认为是真正的结构。以上的其它现有技术代表包括：(参考伪影)Burgert,A.,Letschert,S.,Doose,S.,andSauer,M.Artifactsinsingle-moleculelocalizationmicroscopy.HistochemistryandCellBiology144,123-131(2015)；(参考伪影)Fox-Roberts,P.etal.Localdimensionalitydeterminesimagingspeedinlocalizationmicroscopy.NatureCommunications8,13558(2017)；以及(参考FRC)Nieuwenhuizen,R.P.J.etal.Measuringimageresolutioninopticalnanoscopy.NatureMethods10,557-562(2013)。已经开发出了几个方案来解决交叠的发射体PSF的情况，但是当发射体密度足够高时，它们仍然都产生图像伪影。这些方法简要概述如下。i)多发射体拟合：该方法是在低发射体密度数据中使用的标准单个发射体-单个帧拟合方法的扩展。这里，识别PSF尺度的图像中的局部极大，并且选择该极大周围的小部分图像(与单个发射体拟合一样)。针对一个或更多个发射体，模型PSF被拟合到该部分。通常，增加有贡献的发射体的数量，直到不再观察到对拟合有统计上的显著改善。通常，引入正则化项以限制所拟合的荧光体的数量和/或对其强度施加的限制。当发射体之间的分离不太小(约250nm)并且密度仍然足够低以使得观察到明确限定的局部极大并且交叠的荧光体数量非常低时，该方法会很好地工作。然而，当不满足这些条件中的任何条件时，往往会严重失败。多发射体拟合的示例现有技术包括：(参考ME拟合)Huang,F.,Schwartz,S.,Byars,J.,andLidke,K.Simultaneousmultiple-emitterfittingforsinglemoleculesuper-resolutionimaging.BiomedicalOpticsExpress2,1377–1393(2011)；以及(参考ME拟合)Holden,S.J.,Uphoff,S.andKapanidis,A.N.DAOSTORM:analgorithmforhigh-densitysuper-resolutionmicroscopy.NatureMethods8279-280(2011)。ii)压缩感测：压缩感测是一种完善的信号处理方法，其涵盖广泛的领域和应用。这是一种优化技术，其在某些条件下可以恢复大体欠采样信号，只要该信号足够稀疏(大部分包含零)。在超分辨率显微的上下文中，这意味着具有许多小得多的像素的各个图像帧的较高分辨率变换。然后将所有这些变换后的帧求和以产生最终的超分辨率图像。为了执本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于定位显微的方法，所述方法包括以下步骤：/n接收由显微镜拍摄的显微图像帧的时间序列，所述图像帧是包含发射体或荧光体的图像；/n使用具有不同滤波器特性的多个时间滤波器对帧序列中的相应相同像素位置的像素值的相应组进行时间滤波，以获得帧中的所述相应相同像素位置的多个时间滤波像素值的相应组；以及/n提供时间滤波像素值的所述相应组作为定位算法的输入，以允许依赖于该输入进行发射体或荧光体定位。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180102 GB 1800026.5;20180307 GB 1803638.41.一种用于定位显微的方法，所述方法包括以下步骤：
接收由显微镜拍摄的显微图像帧的时间序列，所述图像帧是包含发射体或荧光体的图像；
使用具有不同滤波器特性的多个时间滤波器对帧序列中的相应相同像素位置的像素值的相应组进行时间滤波，以获得帧中的所述相应相同像素位置的多个时间滤波像素值的相应组；以及
提供时间滤波像素值的所述相应组作为定位算法的输入，以允许依赖于该输入进行发射体或荧光体定位。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，时间滤波的步骤包括：
针对所述图像帧中的像素位置，形成所述图像帧中的所述相同像素位置处的对应像素值的像素轨迹；
对所述像素轨迹中的所述像素值应用第一时间滤波器，以获得第一滤波像素轨迹；以及
对所述轨迹中的所述像素值应用与所述第一时间滤波器不同的至少第二时间滤波器，以获得第二滤波像素轨迹；以及
将所述第一滤波像素轨迹和所述第二滤波像素轨迹组合成单个滤波输出轨迹以供输入到所述定位算法。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
对所述轨迹中的所述像素值应用与所述第一时间滤波器和所述第二时间滤波器不同的至少第三时间滤波器，以获得第三滤波像素轨迹；以及
将所述第一滤波像素轨迹、所述第二滤波像素轨迹和所述第三滤波像素轨迹组合成单个滤波输出轨迹以供输入到所述定位算法。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中，所述第一滤波像素轨迹、所述第二滤波像素轨迹和所述第三滤波像素轨迹被连接在一起以形成组合输出轨迹。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述时间滤波器选自包括以下项的组：
i)哈尔小波核；
ii)巴特沃斯；或者
iii)切比雪夫。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个时间滤波器是相同类型但具有不同时间特性的时间滤波器，其中，所述时间特性与当前正在就像素探寻滤波值的当前帧周围的、对该滤波值的计算有贡献的序列帧的数量有关。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：将所述定位算法应用于时间滤波像素值的所述相应组，以按照比单独使用所述显微镜能够实现的分辨率高的分辨率识别所述输入图像中的位置或发射体或荧光体。
8.一种定位显微系统，所述定位显微系统包括：
显微系统，所述显微系统被设置为生成计算机可读显微图像帧；<...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·马什，S·考克斯，
申请(专利权)人：伦敦大学国王学院，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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