一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法技术

本发明专利技术提供了一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，对采集后的脐带血进行制备分离并在严格控制下向其中加入冷冻保护剂，程控降温仪箱体提前预冷至3℃，降温程序：箱体3℃，3min；以1℃/min的速度降至标本温度‑7℃或箱体‑11℃；以50℃/min的速度降至箱体‑50℃；以15℃/min的速度升至箱体‑25℃，并保持‑25℃等待3min；以1℃/min的速度降至标本‑50℃或箱体‑60℃；以10℃/min的速度降至标本‑90℃或箱体‑120℃，转入液氮长期储存。本发明专利技术对冷冻保护剂的添加过程和程控降温起始温度进行有效控制，并对脐带血标本在由液态冷冻为固态时的散热和温度回升进行更为精准的主动干预和控制，避免了冷冻保护剂对细胞的损伤，能更好的保持脐带血造血干/祖细胞解冻后的增殖能力。

【技术实现步骤摘要】
一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法。
技术介绍
脐带血造血干细胞可以用于造血干细胞移植，治疗血液系统和免疫系统等诸多疾病，有着重要的临床应用价值。脐带血造血干细胞大多以液氮冻存的形式存在于脐带血库中，在临床应用时再进行解冻复苏。脐带血造血干细胞解冻后的细胞活性和增殖能力保持，与脐带血的冻存过程密切相关。常规的脐带血冻存过程见图1。程控降温是冻存过程的核心，通过程控降温，脐带血按照1℃/分钟的降温速率，由0℃以上逐渐降至零下80℃以下的超低温，然后放入液氮长期储存。1℃/分钟是最适合造血干细胞的降温速率，只有保证每份脐带血都尽可能的按照该速率冷冻，才可获得最好的冻存质量和解冻后活力。现有程控降温技术存在以下几个问题：1）对于添加冷冻保护剂前的脐带血标本温度缺乏控制；对于冷冻保护剂的添加过程缺乏控制；对于脐带血标本和冷冻保护剂（主要是DMSO）的接触时长缺乏控制；对于最佳的程控降温起始温度缺乏认识。2）控制相变回温的关键控制点设置不够合理。首先是大幅降温起始的样本温度设置偏高，和实际的样本相变温度差距过大，导致脐带血样本在相变前温度下降明显；其次是大幅降温速率偏小，脐带血样本暴露于超低温中时间过长，导致脐带血样本在相变后降温速率偏大。3）在脐带血标本降温至稳定的-50℃之前，不能始终保持对于造血干细胞最优的1℃/分钟的降温速率，特别是在相变过程中和相变后阶段。4）批量冷冻时，无法通过监测每一份脐带血的样本温度来进行程控降温，导致不同脐带血间的冻存质量差异较大。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，最大程度的避免了脐带血细胞的损伤，并大大提高了脐带血造血干/祖细胞的回收率和细胞活率，更好的保持了脐带血造血干/祖细胞解冻后的增殖能力。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，包括以下步骤：S1，采集后的脐带血在24小时内进行制备分离，去除红细胞和血浆，保留富含造血干细胞的有核细胞成分，为脐带血标本；S2，将所述脐带血标本和冷冻保护剂均置于4℃下预冷至少10分钟，再使用微量注射泵将冷冻保护剂加入到步骤1）得到的脐带血标本中，添加过程中脐带血标本置于0-4℃的低温环境下，添加时长控制在10-15分钟，边加边使用摇床混匀；S3，将程控降温仪箱体提前预冷至3℃，将添加了冷冻保护剂的脐带血标本放入金属保护盒中，然后再放入程控降温仪，开始程控降温，程控降温的程序设置如下：S31，箱体温度3℃，等待3分钟；S32，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-7℃或箱体温度-11℃；S33，箱体温度-50℃/分钟至箱体温度-50℃；S34，箱体温度15℃/分钟至箱体温度-25℃；S35，箱体温度-25℃等待3分钟；S36，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-50℃或箱体温度-60℃；S37，箱体温度-10℃/分钟至样本温度-90℃或箱体温度-120℃；S38，结束；S4，经上述程控降温后的脐带血标本放入液氮中进行长期储存。进一步的，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜和右旋糖苷40的混合物，且冷冻保护剂添加体积为脐带血标本体积的1/4。进一步的，所述冷冻保护剂中二甲基亚砜的体积浓度为50%，右旋糖苷40的质量浓度为5%。本专利技术相比现有技术的有益效果为：1、本专利技术所述的方法相比现有技术，优化了冷冻前准备工作：包括冷冻保护剂的添加和冷冻前的设备准备。具体来说，和现有技术相比，本专利技术增加了添加冷冻保护剂前的预冷过程，即脐带血标本和冷冻保护剂均先放置4℃冰箱预冷10分钟，避免了冷冻保护剂对细胞的损伤。并且本专利技术对冷冻保护剂的添加过程进行严格控制，一是使用微量注射泵，保证缓慢匀速添加，控制时长在10-15分钟，二是添加过程保证0-4℃低温环境，并边加边使用摇床混匀。这样可以有效缓解冷冻保护剂稀释过程中的散热，并保证冷冻保护剂和细胞的充分接触和渗透，在避免冷冻保护剂毒性的同时，又最大程度的发挥其冷冻保护的作用。2、和公示技术相比，本专利技术的程控降温起始温度是3℃，而不是4℃。研究发现当程控降温起始温度小于3.5℃时，可更好的保持解冻后脐带血造血干/祖细胞的增殖能力；3、本专利技术所述的方法对脐带血标本在由液态冷冻为固态时的散热和温度回升进行更为精准的主动干预和控制，并可以同时兼顾个体化冷冻和批量冷冻。4、本专利技术所述的方法可以有效保证脐带血标本在达到稳定的-50℃之前始终保持1℃/分钟的降温速率，最大限度的保持脐带血造血干/祖细胞的活性和增殖能力。附图说明图1为常规的脐带血冻存过程示意图；图2为冷冻前DMSO暴露时长对脐带血解冻后CD34+细胞活性的影响（n=605）结果图；图3为程控降温起始温度对脐带血解冻后CFU回收率的影响（n=1119）结果图；图4为不同降温速率对脐带血解冻后CFU回收率的影响（n=4）结果图；图5为大幅降温起始箱体温度对解冻后CD34+细胞回收率的影响（n=1119）结果图；图6为使用样本温度监测运行的脐带血程控降温曲线；图7为使用箱体温度监测运行的脐带血程控降温曲线；图8为分别通过箱体温度和样本温度监测批量进行脐带血程控降温（n=5）脐带血造血干细胞解冻后CFU回收率对比图。具体实施方式实施例1本实施例提供了一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，包括以下步骤：S1，采集后的脐带血在24小时内进行制备分离，去除红细胞和血浆，保留富含造血干细胞的有核细胞成分，为脐带血标本；同时，选择和要冻存的脐带血具有近似的有核细胞数和红细胞压积的废弃脐带血，按照和所述脐带血标本一样的方法进行制备和加入冷冻保护剂，作为后续程控降温时的参照标本；S2，将所述脐带血标本和冷冻保护剂均置于4℃下预冷10分钟，再使用微量注射泵将冷冻保护剂加入到步骤1）得到的脐带血标本中，添加过程中脐带血标本置于0-4℃的低温环境下，添加时长控制在10-15分钟，边加边使用摇床混匀；添加了冷冻保护剂的脐带血标本需0-4℃保存，在20分钟内进行程控降温冷冻处理；S3，将上述参照标本放入程控降温仪，将样本探针插入参照标本，用于标本温度监测，将程控降温仪箱体提前预冷至3℃，将添加了冷冻保护剂的脐带血标本放入金属保护盒中，然后再放入程控降温仪，开始程控降温，程控降温的程序设置如下：S31，箱体温度3℃，等待3分钟；S32，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-7℃或箱体温度-11℃；S33，箱体温度-50℃/分钟至箱体温度-50℃；S34，箱体温度15℃/分钟至箱体温度-25℃；S35，箱体温度-25℃等待3分钟；S36，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-50℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/nS1，采集后的脐带血在24小时内进行制备分离，去除红细胞和血浆，保留富含造血干细胞的有核细胞成分，为脐带血标本；/nS2，将所述脐带血标本和冷冻保护剂均置于4℃下预冷至少10分钟，再使用微量注射泵将冷冻保护剂加入到S1得到的脐带血标本中，添加过程中脐带血标本置于0-4℃的低温环境下，添加时长控制在10-15分钟，边加边使用摇床混匀；/nS3，将程控降温仪箱体提前预冷至3℃，将添加了冷冻保护剂的脐带血标本放入金属保护盒中，然后再放入程控降温仪，开始程控降温，程控降温的程序设置如下：/nS31，箱体温度3℃，等待3分钟；/nS32，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-7℃或箱体温度-11℃；/nS33，箱体温度-50℃/分钟至箱体温度-50℃；/nS34，箱体温度15℃/分钟至箱体温度-25℃；/nS35，箱体温度-25℃等待3分钟；/nS36，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-50℃或箱体温度-60℃；/nS37，箱体温度-10℃/分钟至样本温度-90℃或箱体温度-120℃；/nS38，结束；/nS4，经上述程控降温后的脐带血标本放入液氮中进行长期储存。/n...

【技术特征摘要】
1.一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1，采集后的脐带血在24小时内进行制备分离，去除红细胞和血浆，保留富含造血干细胞的有核细胞成分，为脐带血标本；
S2，将所述脐带血标本和冷冻保护剂均置于4℃下预冷至少10分钟，再使用微量注射泵将冷冻保护剂加入到S1得到的脐带血标本中，添加过程中脐带血标本置于0-4℃的低温环境下，添加时长控制在10-15分钟，边加边使用摇床混匀；
S3，将程控降温仪箱体提前预冷至3℃，将添加了冷冻保护剂的脐带血标本放入金属保护盒中，然后再放入程控降温仪，开始程控降温，程控降温的程序设置如下：
S31，箱体温度3℃，等待3分钟；
S32，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-7℃或箱体温度-11℃；
S33，箱体温度-50℃/分...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏晓飞，李红莉，张昱，
申请(专利权)人：北京佳宸弘生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11