一种诱导胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法和培养基技术

一种诱导人胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法和培养基。该方法包括：将由人胚胎干细胞诱导分化形成的上皮细胞置于子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中培养以诱导分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞；子宫内膜腺上皮分化培养基含有：EGF、FBS、GlutaMAX以及WNT3A。该方法可以诱导人胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞，操作简单、一个胚胎干细胞克隆即可产生百万级的高产量和近乎100％的高纯度的子宫内膜腺上皮前体细胞，且由该方法所得的子宫内膜腺上皮前体细胞可用于治疗子宫内膜缺失、子宫内膜内膜增生困难、宫腔黏连、子宫源性早期流产等相关疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种诱导胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法和培养基
本公开涉及干细胞治疗
，具体而言，涉及一种诱导胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法和培养基。
技术介绍
子宫内膜是一种独特的组织，经历生长，分化和剥脱的周期性过程并在每个月经周期中更新。子宫内膜的再生对于胚胎植入和维持妊娠至关重要。子宫肌瘤切除术引起严重的子宫内膜损伤，刮宫，子宫内膜炎或子宫内膜结核导致子宫内膜菲薄、宫腔黏连、子宫内膜疤痕形成和纤维化，从而引起子宫异常出血，流产，妊娠并发症或不孕。严重的子宫内膜损伤丧失生育功能，需要代孕或领养婴儿。目前治疗宫腔黏连的只要手段是宫腔镜下黏连分离同时辅以宫内节育器插入，Foley球囊导管，透明质酸应用或雌激素治疗来完成，但严重粘连的宫腔粘连复发率在20％-62.5％之间。宫腔黏连发生的病理学基础在于内膜基底层的破坏，导致内膜上皮干细胞的丢失，导致大量的基质细胞的增生，形成成纤维细胞甚至软骨细胞，内膜的粘膜面丧失，被纤维瘢痕组织取代。干细胞的治疗在补充子宫内膜基底层上皮干细胞的应用中具有广阔的前景。目前已有的临床实验中有骨髓和脐带间充质来源的间充质干细胞，但这些干细胞都来源于中胚层的间充质细胞，其分化潜能存在很大的争议，目前没有实验证据表明这些中胚层来源的间充质干细胞能在体外分化出子宫内膜腺上皮干细胞。所以其在临床应用治疗宫腔黏连或薄型子宫内膜的机理尚不清楚。从子宫内膜分离出的组织干细胞一被证明是子宫内膜上皮的前体细胞，体外形成colony的内膜上皮细胞通过3D培养体系，能够为子宫内膜上皮细胞提供可靠的来源并且可以传代，但是产量非常低，其上皮干细胞colony从内膜细胞中的分离率约1/10000。这使得子宫内膜上皮干细胞的产量严重受限。鉴于此，特提出本公开。公开内容本公开的目的在于提供一种诱导人胚胎干细胞分化形成子宫内膜上皮前体细胞的方法。该方法可以诱导胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞，具有操作简单、无上限的产量和近乎100％的高纯度等特点，且由该方法所得的子宫内膜腺上皮前体细胞可用于治疗子宫内膜缺失、子宫内膜内膜增生困难、宫腔黏连、早期流产等相关疾病。本公开的目的在于提供一种用于诱导人胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的培养基，该培养基可以用于诱导胚胎干细胞形成子宫内膜腺上皮前体细胞。本公开的目的在于提供一种子宫内膜腺上皮前体细胞，该子宫内膜腺上皮前体细胞只能定向分化为成熟的子宫内膜腺上皮细胞，以患者本人的基质细胞作为Niche细胞，无免疫排斥，安全可靠，可用于治疗子宫内膜缺失、子宫内膜内膜增生困难、宫腔黏连、早期流产等相关疾病。本公开的目的在于提供上述子宫内膜腺上皮前体细胞的应用。本公开是这样实现的：作为生殖系统中的一员的子宫虽然来源于中胚层，但是子宫内膜中主要含有两类细胞，一类是基质细胞，分化出血管，神经和纤维等支持组织，来源于中胚层；另一类细胞是上皮细胞，分化出粘液上皮和腔上皮，是子宫内膜的功能细胞，却是来源于内胚层或由中胚层转化而来。由于从胚胎干细胞分化出来的前体干细胞以患者的内膜基质细胞作为Niche细胞，没有免疫源性，可以用于临床，且产量丰富，那么从胚胎干细胞诱导分离纯的子宫内膜腺上皮前体细胞具有广阔的临床应用前景。但目前，缺乏从胚胎干细胞诱导分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法。基于此，一方面，本公开提供了一种诱导人胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法，其包括以下步骤：上皮细胞分化步骤：将由人胚胎干细胞诱导分化形成的内胚层细胞置于上皮细胞分化培养基中以诱导分化形成上皮细胞；子宫内膜腺上皮前体细胞分化步骤：将得到的所述上皮细胞置于子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中培养以诱导分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞；其中，上皮细胞分化培养基含有如下组分：EGF(表皮细胞生长因子)、FBS(胎牛血清)以及GlutaMAX；其中，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基含有如下组分：EGF、FBS、GlutaMAX及WNT3A。可选地，在本公开的一些实施方案中，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，EGF的浓度为5-15ng/ml。例如，EGF的浓度可以是10、11、12、13、14或50ng/ml中的任意一者或两者之间的范围。可选地，在本公开的一些实施方案中，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，FBS的含量为5％-15％。可选地，在本公开的一些实施方案中，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，GlutaMAX的浓度为1-3mM。可选地，在本公开的一些实施方案中，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，WNT3A的浓度为150-250ng/ml。例如，WNT3A的浓度可以是150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250ng/ml中的任意一者或两者之间的范围。可选地，在本公开的一些实施方案中，上皮细胞分化培养基中，EGF浓度为5-15ng/ml，FBS含量为5％-15％，GlutaMAX的浓度为1-3mM。可选地，在本公开的一些实施方案中，上皮细胞分化培养基由基础培养基DMEM/F12添加EGF，FBS以及GlutaMAX得到。可选地，在本公开的一些实施方案中，在上皮细胞分化步骤中，所述内胚层细胞为CD324和CD184表达呈阳性的内胚层细胞。可选地，在本公开的一些实施方案中，在子宫内膜腺上皮前体细胞分化步骤中，所述上皮细胞为SOX17表达呈阳性的纯上皮细胞。可选地，在本公开的一些实施方案中，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基含有如下组分：10ng/mlEGF、10％FBS、2mMGlutaMAX以及200ng/mlWNT3A。可选地，在本公开的一些实施方案中，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基由基础培养基DMEM/F12添加10ng/mlEGF、10％FBS、2mMGlutaMAX以及200ng/mlWNT3A得到。可选地，在本公开的一些实施方案中，在子宫内膜腺上皮前体细胞分化步骤中，诱导分化培养的时间为7-14天。可选地，在本公开的一些实施方案中，在诱导分化步骤之前，所述方法还包括：内胚层诱导分化步骤；所述内胚层诱导分化步骤包括：使用STEMdiffDefinitiveEndodermKit诱导所述人胚胎干细胞分化形成得到所述内胚层细胞。可选地，在本公开的一些实施方案中，在所述内胚层诱导分化步骤中，诱导分化培养的时间为4天；优选的，在上皮细胞诱导分化步骤中，诱导分化培养的时间为3天。本公开提供了一种用于诱导胚胎干细胞分化形成上皮细胞的培养基，以Fibronectin铺层，其含有如下组分：EGF、FBS和GlutaMAX，基础培养基为DMEM/F12。另一方面，本公开提供了一种用于诱导胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的培养基，以Matrigel铺层，在3D培养基中培养，以基质细胞作为Niche细胞，培养基含有如下组分：EGF、FB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导人胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：/n上皮细胞分化步骤：将由人胚胎干细胞诱导分化形成的内胚层细胞置于上皮细胞分化培养基中以诱导分化形成上皮细胞；/n子宫内膜腺上皮前体细胞分化步骤：将得到的所述上皮细胞置于子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中培养以诱导分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞；/n其中，上皮细胞分化培养基含有如下组分：EGF、FBS以及GlutaMAX；/n子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基含有如下组分：EGF、FBS、GlutaMAX以及WNT3A。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种诱导人胚胎干细胞分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
上皮细胞分化步骤：将由人胚胎干细胞诱导分化形成的内胚层细胞置于上皮细胞分化培养基中以诱导分化形成上皮细胞；
子宫内膜腺上皮前体细胞分化步骤：将得到的所述上皮细胞置于子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中培养以诱导分化形成子宫内膜腺上皮前体细胞；
其中，上皮细胞分化培养基含有如下组分：EGF、FBS以及GlutaMAX；
子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基含有如下组分：EGF、FBS、GlutaMAX以及WNT3A。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，EGF的浓度为5-15ng/ml。


根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，FBS的含量为5％-15％。


根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，GlutaMAX的浓度为1-3mM。


根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，子宫内膜腺上皮前体细胞分化培养基中，WNT3A的浓度为150-250ng/ml。


根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：江秀秀，
申请(专利权)人：江秀秀，
类型：发明
国别省市：浙江;33