包含垂体组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块技术

本发明专利技术的课题在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含垂体组织的细胞团块的手段。包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(1)及(2)：(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含垂体组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块
本专利技术涉及包含垂体组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块。本专利技术进一步涉及在细胞团块中包含神经系统细胞或神经组织、和垂体组织、以及间充质细胞的细胞团块。
技术介绍
垂体为在头部存在的内分泌器官，产生促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素等对生物体的维持、生长而言重要的各种垂体激素。在由于垂体的发育不全、垂体功能减退、垂体腺瘤等疾病而产生垂体的功能失调的情况下，产生类似于发育障碍，生殖器相关的异常，肾上腺、甲状腺的异常的严重病情。一般而言，已受到损伤的垂体组织极少自然再生而恢复功能。在专利文献1及非专利文献1、2中报告了通过将人多潜能干细胞在BMP信号转导途径抑制因子乃至作用因子、Sonichedgehog(在本说明书中有时记载为Shh)信号转导途径作用因子及TGF-β信号转导途径抑制剂的存在下诱导分化，由此制备了包含垂体细胞的源自头部基板的细胞。然而，制备的细胞是二维培养而成的，达不到重现对功能的发挥而言重要的生物体的复杂垂体组织的结构。因此，迫切期望可以有效的制备立体的垂体组织的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2016-538856号公报非专利文献非专利文献1：Dinceretal.CellReports5，1387-1402，2013.非专利文献2：Zimmeretal.StemCellReports6，858-872，2016
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含垂体组织的细胞团块的手段。特别是提供有效地制备包含在组织中含有垂体组织干细胞的高品质垂体组织的细胞团块的手段。具体而言，提供通过可以将无饲养细胞培养的多潜能干细胞作为起始材料，降低昂贵的重组蛋白质的使用量由此进行更便宜的制备，从而有效制备的手段。解决问题的方法本专利技术人在为解决上述问题进行反复研究时发现，通过在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，添加BMP信号转导途径作用物质和Sonichedgehog信号转导途径作用物质，由此可以有效地制备包含垂体组织的细胞团块。进一步发现，通过在上述Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养前，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中培养，由此可改善细胞团块的制备效率。此外，通过将BMP信号转导途径作用物质的添加条件最优化，鉴定从悬浮培养开始72小时以内的所谓最适添加时期，成功进行了由低于以往的浓度的BMP4引起的垂体组织的诱导分化。即，本专利技术涉及以下内容。[1]包含垂体组织的细胞团块的制备方法：包括下述步骤(1)及(2)：(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。[2]包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(a)、(1)及(2)：(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中培养；(1)第一步骤，将经a步骤培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到含有垂体组织的细胞团块。[3]包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(1)、(2-1)及(2-2)：(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2-1)第二步骤(1)，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养；(2-2)第二步骤(2)，将经第二步骤(1)悬浮培养的聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。[4]包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(a)、(1)、(2-1)及(2-2)：(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中培养；(1)第一步骤，将经a步骤培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2-1)第二步骤(1)，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养；(2-2)第二步骤(2)，将第二步骤(1)得到的聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(2)或步骤(2-1)中的BMP信号转导途径作用物质在上述步骤(1)中多潜能干细胞的悬浮培养开始时的0.5小时以后，72小时以内进行添加。[6]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(2)或步骤(2-1)中的BMP信号转导途径作用物质在由上述步骤(1)形成的聚集体的表层的细胞的1成以上形成紧密连接的时期内进行添加。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质为选自BMP2、BMP4、BMP7及GDF7中的至少一种蛋白质。[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质为BMP4。[9]根据[8]所述的制备方法，其中，上述步骤(2)或步骤(2-1)中的悬浮培养利用上述BMP4的浓度为10pM～5nM的培养基进行。[10]根据[3]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(2-2)中的BMP信号转导途径抑制物质的添加在上述步骤(2-1)中的BMP信号转导途径作用物质的添加起12小时以后，20天以内实施。[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质具有对非经典Wnt途径的抑制活性。[12]根据[1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质为PORCN抑制剂。[13]根据[12]所述的制备方法，其中，上述PORCN抑制剂为选自：IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、Wnt-C59、ETC-159及GNF-6231中的至少一种化合物。[14]根据[1]～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(1)及(2)：/n(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；/n(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171124 JP 2017-2263121.包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(1)及(2)：
(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。


2.包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(a)、(1)及(2)：
(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中培养；
(1)第一步骤，将a步骤培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到含有垂体组织的细胞团块。


3.包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(1)、(2-1)及(2-2)：
(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；
(2-1)第二步骤(1)，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养；
(2-2)第二步骤(2)，将第二步骤(1)悬浮培养的聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。


4.包含垂体组织的细胞团块的制备方法，包括下述步骤(a)、(1)、(2-1)及(2-2)：
(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中培养；
(1)第一步骤，将a步骤培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；
(2-1)第二步骤(1)，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质及Sonichedgehog信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养；
(2-2)第二步骤(2)，将第二步骤(1)悬浮培养的聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，得到包含垂体组织的细胞团块。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径抑制物质为PORCN抑制剂。

【专利技术属性】
技术研发人员：中野德重，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP