检测和促进心磷脂重塑和心肌细胞成熟的方法和组合物以及治疗线粒体功能障碍的相关方法技术

本公开的实施方案涉及用于诱导心肌细胞成熟的方法和组合物。在一些实施方案中，心肌细胞体外衍生自干细胞。在一些实施方案中，该组合物和方法通过在心肌细胞中诱导Let7i microRNA(miRNA)的过表达、miR‑452的过表达、miR‑122的降低表达和/或miR‑200a的降低表达来诱导成熟。在其他实施方案中，本公开涉及用于治疗诸如脂肪酸氧化紊乱等以线粒体功能障碍为特征的病症的方法。在其他实施方案中，本公开涉及筛选影响心脏肌肉功能的化合物的方法。在其他实施方案中，本公开涉及通过检测或监测细胞的心磷脂概况来检测或监测细胞中的线粒体功能障碍的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测和促进心磷脂重塑和心肌细胞成熟的方法和组合物以及治疗线粒体功能障碍的相关方法相关申请的交叉引用本申请要求享有2017年12月8日提交的美国临时申请62/596,438和2018年5月22日提交的美国临时申请62/674,978的权益，据此通过援引将其全部内容收入本文。关于序列表的声明与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且据此通过援引收录入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为67910_Sequence_Listing_Final_2018-12-07.txt。文本文件为11KB；创建于2018年12月7日；并通过EFS-Web在提交说明书的同时提交。政府特许权声明本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的基金P01GM081619和R01GM083867和R01GM097372和R01HL135143和U01HL099993和U01HL099997的政府支持下进行的。政府拥有本专利技术的某些权利。背景线粒体三功能蛋白(Mitochondrialtrifunctionalprotein，MTP/TFP)缺乏被认为是由于羟酰基-CoA脱氢酶/3酮酰基-CoA硫解酶/烯酰-CoA水合酶亚基A(HADHA/LCHAD)或亚基B(HADHB)突变所致脂肪酸氧化(FAO)受损的结果。MTP缺陷型新生儿的主要表型是婴儿猝死综合症(SIDS)，其在婴儿出生后在孩子开始使用富含脂质的母乳喂养时出现。FAO的缺陷在促进心律失常前的心脏环境中起作用，但是，确切的作用机制尚不清楚，目前尚无治疗方法。多能干细胞衍生的心肌细胞(hPSC-CM)提供了一种在体外研究人类疾病的方法，但由于它们的不成熟性而受到限制，因为它们代表了胎儿心肌细胞(FCM)而不是成人心肌细胞(ACM)。由于缺乏有关如何将成熟的心肌细胞从未成熟的FCM转变为成熟的ACM的知识，许多出生后发作的心脏病没有很好的表征。在心脏发生期间，FCM经历发育状态，一旦超过了心肌细胞的表现，就会展现出：细胞周期退出，自发搏动停止，乳酸利用，然后在出生后阶段利用脂肪酸作为主要能源和心磷脂成熟。由于未成熟的hPSC-CM无法通过FAO利用脂肪酸作为能源，因此它们在模拟FAO疾病中的使用受到限制。使hPSC-CMs趋向ACM成熟的当前方法聚焦于用电刺激或机械刺激在物理上刺激细胞或通过2D表面图案提示直接指导细胞定向的延长培养过程。尽管在心脏发生和线粒体三功能蛋白(MTP/TFP)的研究方面取得了进展，但仍需要开发成人心肌细胞以促进用于研究出生后发生的心脏病的模型。本公开解决了这个和相关需求。概述提供本概述以简化形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详述中进一步描述。该概述不旨在标识所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。一方面，本公开提供了一种诱导心肌细胞成熟的方法。该方法包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下两种或更多种：Let7imicroRNA(miRNA)的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。在一个实施方案中，该方法包括在未成熟的心肌细胞中诱导Let7imiRNA的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。在另一方面，本公开提供了通过本文描述的任何方法产生的心肌细胞。在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的方法，该受试者具有通过施用具有成熟心磷脂概况的心肌细胞可治疗的病症。该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的心肌细胞。在另一方面，本公开提供了筛选用于调节心脏功能的化合物的方法。该方法包括使一种或多种如本文所述的心肌细胞与候选药剂接触；并测量该一个或多个心肌细胞中的心脏功能参数；其中心脏功能参数的变化指示候选药剂调节心脏功能。在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者中线粒体脂肪酸氧化(FAO)失调的方法。该方法包括施用有效量的稳定受试者的线粒体中的心磷脂概况或促进成熟的心磷脂重构的组合物。在另一方面，本公开提供了一种检测培养的心肌细胞的病理状态的方法。该方法包括确定心肌细胞中的心磷脂概况，其中具有大于18个碳的酰基链的心磷脂的相对增加以及具有小于18个碳的酰基链的心磷脂的相对减少指示心肌细胞的病理状态降低。在另一方面，本公开内容提供了诱导培养的心肌细胞成熟的组合物或组合物的试剂盒。该组合物或试剂盒包含以下两种或多种：编码Let7imicroRNA的核酸构建体，编码miR-452的核酸构建体，是或编码与编码miR-122的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体，以及是或编码与编码miR-200a的序列的一部分杂交的寡聚物的核酸构建体。附图说明当结合附图时，通过参考以下详述，本专利技术的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易领会也更好理解，其中：图1A-1F说明了HADHA突变体(Mut)和敲除(KO)干细胞来源的心肌细胞的产生。图1A)是详述四个酶促步骤的脂肪酸β-氧化的示意图。图1B)是来自WTCiPSC系的显示导致早期终止密码子的22bp缺失的HADHAKODNA和蛋白质序列示意图。示意的HADHAWTDNA片段序列如SEQIDNO：1所示，相应的HADHAWT蛋白质片段序列如SEQIDNO：2所示。示意的HADHAKODNA片段序列如SEQIDNO：3所示，相应的HADHAKO蛋白质片段序列如SEQIDNO：4所示。指示了外显子，内含子和In/Del域。图1C)来自WTCiPSC系的显示在第一个等位基因上有2bp的缺失和9bp的插入且在第二个等位基因上有2bp的缺失的HADHAMutDNA和蛋白质序列的示意图。示意的HADHAWTDNA片段序列如SEQIDNO：5所示。示意的HADHAMutDNA片段序列如SEQIDNO：7和9所示。RNA测序读取计数显示HADHAMut表达外显子4-20，导致截短的蛋白质。图1D)对WTCiPSC中HADHA表达和持家蛋白β-肌动蛋白的Western分析(蛋白质印迹分析)。图1E)针对心脏标记物α辅肌动蛋白(左)和HADHA(右)的WT、HADHAMut和HADHAKOhiPSC-CM的共聚焦显微镜检查。图1F)WT、HADHAMut和HADHAKOhiPSC-CM的脂肪酸氧化能力的海马分析追踪。图2A-2F图示了心肌细胞成熟microRNA筛选的方面。图2A)为确定候选microRNA以筛选心肌细胞成熟而进行的工作流程示意图。图2B)为产生经microRNA转导的干细胞衍生的心肌细胞而进行的工作流程的示意图。图2C)经microRNA处理的hiPSC-CM的细胞面积分析。MicroRNA-208bOE导致细胞面积显著增加，而miR-205KO导致显著减少。对细胞进行α辅肌动蛋白、鬼笔环肽染色和用DAPI染色，并用共聚焦显微镜成像。图2D)经microRNA处理的hiPSC-CM的微电极阵列分析校正了场电势持续时间(cFPD)。MiR-452OE导致更长的cFPD。图2E)使用微柱测定法(micro-p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导心肌细胞成熟的方法，其包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下两种或多种：Let7i microRNA(miRNA)的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171208 US 62/596,438;20180522 US 62/674,9781.一种诱导心肌细胞成熟的方法，其包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下两种或多种：Let7imicroRNA(miRNA)的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。


2.权利要求1的方法，其包括在未成熟的心肌细胞中诱导以下三种或更多种：Let7imiRNA的过表达，miR-452的过表达，miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。


3.权利要求2的方法，其包括在未成熟的心肌细胞中诱导Let7imiRNA的过表达、miR-452的过表达、miR-122的降低表达和miR-200a的降低表达。


4.权利要求1-3之一的方法，其中诱导过表达包括使未成熟的心肌细胞与包含编码待过表达的miRNA的核酸的载体接触。


5.权利要求4的方法，其中所述载体被配置为促进编码待过表达的miRNA的核酸的瞬时表达。


6.权利要求4的方法，其中所述载体是病毒载体，其被配置为将编码待过表达的miRNA的核酸整合入未成熟心肌细胞的基因组中。


7.权利要求6的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或腺伴随病毒载体。


8.权利要求1-3之一的方法，其中诱导miRNA的降低表达包括使未成熟的心肌细胞与和被靶向进行降低表达的miRNA杂交的核酸片段接触，或与包含编码与被靶向进行降低表达的miRNA杂交的转录物的核酸的载体接触。


9.权利要求1的方法，其中诱导降低表达包括实施编码miRNA的基因的敲除。


10.权利要求1-3之一的方法，其中诱导降低表达包括向未成熟的心肌细胞提供核酸酶和引导核酸，该引导核酸具有促进所述核酸酶对编码被靶向进行降低表达的所述miRNA的核酸进行特异性切割的序列。


11.权利要求10的方法，其中向未成熟的心肌细胞提供核酸酶包括使所述未成熟的心肌细胞与所述核酸酶或编码所述核酸酶的载体接触，其中所述载体被配置为促进所述酶在心肌细胞中的表达。


12.权利要求10的方法，其中为未成熟的心肌细胞提供引导核酸包括使所述未成熟的心肌细胞与该引导核酸或编码该引导核酸的载体接触，其中所述载体被配置为促进该引导核酸在心肌细胞中的表达。


13.权利要求10的方法，其中所述核酸酶是核酸内切酶，诸如Cas9或TALENS。


14.权利要求8、11或12的方法，其中该载体是病毒载体。


15.权利要求14的方法，其中该病毒载体是慢病毒载体或腺相关病毒载体。


16.权利要求1的方法，其中所述未成熟的心肌细胞衍生自干细胞。


17.权利要求14的方法，其中所述未成熟的心肌细胞在体外衍生自干细胞。


18.权利要求16或权利要求17的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞、多能干细胞或诱导的多能干细胞。


19.权利要求1-18之一的方法，进一步包括使所述未成熟的心肌细胞与选自棕榈酸、油酸和亚油酸的两种或更多种长链脂肪酸接触。


20.权利要求19的方法，其中所述一种或多种长链脂肪酸包括棕榈酸酯、油酸和亚油酸。


21.权利要求1-20之一的方法，其中所述心肌细胞包括遗传畸变。


22.权利要求21的方法，其中所述遗传畸变与心脏中的代谢或病理疾病状态相关。


23.权利要求22的方法，其中所述遗传畸变与脂肪酸氧化(FAO)紊乱有关。


24.权利要求22的方法，其中所述心肌细胞在编码下述之一的基因中包含突变：HADHA,FATP1,FACS1,OCTN2,L-CPTI,M-CPTI,CAT,CPTII,VLCAD,LCAD,MCAD,SCAD,LCHAD,SHYD,M/SCHAD,SKAT,MKAT,HS,HL,ETF,和ETFQO。


25.通过权利要求1-24之一中所述的任何方法产生的心肌细胞。


26.权利要求25的心肌细胞，其中所述心肌细胞包含遗传畸变。


27.权利要求26的心肌细胞，其中所述遗传畸变与脂肪酸氧化(FAO)紊乱有关。


28.权利要求27的心肌细胞，其中所述遗传畸变是编码HADHA的基因中的突变。


29.一种治疗患有通过施用具有成熟心磷脂概况的心肌细胞能够治疗的病症的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求25中所述的心肌细胞。


30.权利要求29的方法，其中所述受试者具有受损的心脏组织或细胞。


31.权利要求29的方法，其中所述受试者患有糖尿病、先天性心脏病、局部缺血、肌病、线粒体疾病和/或患有梗塞。


32.权利要求29的方法，其中所述线粒体疾病是脂肪酸氧化(FAO)紊乱。


33.权利要求29的方法，其中所述受试者在编码HADHA的基因中具有突变。


34.权利要求29的方法，其中所述受试者经历心律不齐。


35.权利要求29的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·米克拉斯，H·劳霍拉贝克，Y·王，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：美国;US