一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法技术

本发明专利技术涉及医用、保健产品技术领域，特别涉及一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法，首先获取自体或异体具有活跃再生能力的人体肌肉干细胞，通过体外培养大量扩增，建立长期应用的细胞系。通过在低温条件下超声波破碎细胞，离心后收集上清，过滤以及浓缩得到肌肉干细胞提取物，合并以干细胞培养液的提取物，加以活性稳定剂、防腐剂，再混合以渗透剂，得到活性因子组合物。本发明专利技术的有益效果是：干细胞活性因子组合物能够对受损肌肉与皮肤进行很好的修复和再生长作用；可以促进皮肤衰老状态的改善。

【技术实现步骤摘要】
一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法
本专利技术涉及医用、保健产品
，特别涉及一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法。
技术介绍
干细胞在细胞治疗、组织器官修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景。在基础研究与临床应用中起着越来越重要的作用。然而，相对于许多成体干细胞，肌肉干细胞在国内的研究和临床应用还处于落后状态。骨骼肌是机体中最重要的肌肉之一，负责为多种机体功能提供支持。不同于所有其他组织骨骼肌肌肉组织专门控制主动运动，而个体的激烈活动，运动锻炼，甚至日常行动都在不断制造程度不同的肌肉组织和细胞的物理微损伤。肌肉自身的损伤修复是必须通过肌肉干细胞实现的。人体内的相当数量的肌肉干细胞则在不断的生长分化来执行修复活动，用以修复肌肉微损伤。年轻个体的肌肉组织有强大的修复能力。随着人体的老化，肌肉的功能和修复能力会发生显著降低。目前，进程性的肌无力和再生障碍，困扰着广大的老龄人群。各种肌肉萎缩症，例如杜氏肌营养不良症，也会在年幼和年轻的病人身上发生。肌肉萎缩症和再生障碍和人体肌肉干细胞的数量和功能的衰竭直接相关。随年龄增长或一些疾病的发生，肌肉干细胞的衰竭持续发生。衰老个体的肌肉干细胞的再生性修复能力随着其老化也逐渐减退直至消失，然而这个过程并非不可逆，体外的培养和刺激可以促进衰老的肌肉干细胞的再生能力的恢复，肌肉干细胞的再生能力和体外培养传代数很高，由于具有较强的端粒酶活性，肌肉干细胞的增生能力很强。从少量组织提取细胞开始培养就能得到稳定细胞系，可以体外连续培养至少30代还保持干细胞的活跃再生活力。肌肉干细胞的活跃再生能力主要体现在强大的再生能力，抗氧化危机能力，和大量活性因子的产生或分泌。强大再生能力体现在肌肉干细胞有强大的多功能分化能力，已有的证据表明肌肉干细胞不仅可分化成肌肉细胞，还可分化成成骨细胞，成软骨细胞，心肌细胞，神经细胞等等。肌肉干细胞已被证明可很好的促进骨、软骨、筋膜、心肌和神经组织损伤的修复。肌肉干细胞的活跃再生能力也体现在肌肉干细胞在正常生理条件下处于更活化的状态。肌肉干细胞由于需要修复肌肉微损伤，相较于其他一些干细胞例如脂肪干细胞，肌肉干细胞是相对被激活的状态。肌肉干细胞也具有较强的自我修复的功能系统。肌肉干细胞的强大抗氧化能力体现在高表达水平的乙醛脱氢酶(ALDH)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)等。疤痕是各种创伤造成的正常皮肤组织的外观形态以及组织病理学改变的统一称呼，是机体创伤修复期间必然的产物，长度超过一定的限度，就会引发各种各样的并发症，对患者的健康生活质量造成较大影响。疤痕一般累及表皮或真皮浅层，皮肤表面粗糙或有色素变化，局部平坦、柔软，一般无功能障碍，随着时间的推移，瘢痕将逐渐不明显。研究表明，人体皮肤受损是引发瘢痕的主要因素，其中瘢痕疙瘩就是一种特殊类型，全身诱因也许是主要作用，特别是特异性身体素质因素，并且具有一定的遗传性。肌肉干细胞所具备的增殖分化能力，可以向皮肤受损部分分化，且肌肉干细胞产生的活性因子可以促进新皮肤组织的生成，减少疤痕组织的产生。皮肤衰老是随着年龄增长而发生的皮肤生理性衰老，与真皮成纤维细胞减少、衰老密切相关，肌肉干细胞的基础特征之一即具有多向分化潜能，能在特定条件下激活或分化为成纤维细胞，进而促进创伤愈合和组织修复，由于肌肉组织中成纤维细胞的增多，对皮肤的衰老也起到显著的延缓作用。综合相关的研究成果可知，肌肉干细胞产生的活性因子至少包括以下4类：(1)常见的细胞生长因子。目前已知的如成纤维细胞生长因子(FGF)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，神经生长因子(NGF)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，肝细胞生长因子(HGF)，抗炎症类的白细胞介素类生长因子(Interleukin,IL)等。(2)肌肉细胞和肌纤维生长特需的因子。肌纤维细胞生长因子又称肌细胞因子(MGF)，是具有刺激肌纤维细胞生长活性的细胞因子。肌细胞细胞生长因子(MGF)通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，是调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。(3)抗衰老和炎症的活性蛋白，目前已知关键的如Sirt1，Notch，Klotho，progranulin等等。这些活性蛋白与促进细胞生长、增生，以及伤口的愈合和制止长期发炎作用有重要关联。(4)具有修复功能的囊泡体(exosome)所包含的因子。肌肉干细胞可分泌大量的囊泡体以作用于其他的细胞，囊泡体包含有各种蛋白，多肽，核酸和其他活性因子。肌肉组织占人体很大比重，而体育运动和肌肉的锻炼可以直接或间接地提升人体整体健康状态。而且因为从肌肉干细胞分泌大量良性因子，肌肉组织会直接影响体内的其他组织，比如骨骼，血管，和皮肤等等。即使开始锻炼的年纪较晚，运动也能逆转人们的肌肉以及其他器官的老化。肌肉干细胞的来源和血管壁细胞紧密相关。体育锻炼可增加血管健康，增加毛细血管数量和血管壁细胞数量，从而改善肌肉干细胞的生存微环境和功能。因此健康肌肉包含更多的肌肉干细胞。体育运动或者肌肉损伤后，肌纤维细胞生长因子(MGF)的表达会大量升高。肌纤维细胞生长因子对肌肉的生长和损伤修复有特异的促进作用。肌纤维细胞生长因子(MGF)促进细胞内脂肪类能量的代谢。在增加肌肉生长的同时，对减少体内脂肪有正面作用。类似于运动后肌纤维细胞生长因子(MGF)对肌肉的直接功效，肌纤维细胞生长因子(MGF)也可以直接作用于皮肤细胞。促进皮肤血管新生，使皮肤萎缩，堵塞或消失的毛细血管内皮细胞新生，皮肤血管网增多，血流增加，皮肤营养充足，从而使皮肤充满活力。肌纤维细胞生长因子(MGF)促使肌肉纤维细胞分裂增殖，分泌胶原纤维，网状纤维和弹性纤维，保持肌肉弹性和厚度。由于肌纤维细胞生长因子(MGF)是由正常细胞分泌，既无药物类毒性，也无免疫反应，因此在研究其生理作用机制同时，已试用于临床治疗。用于人烧伤、创伤、静脉曲张性皮肤溃疡和角膜损伤，可促进伤口愈合。肌肉干细胞的总提取物还可能包含其他更多的未知的类似于肌纤维细胞生长因子(MGF)的蛋白多肽因子。肌肉干细胞和成纤维化细胞(fibroblast)在肌肉损伤后再生过程中的作用是互相调节的。肌肉干细胞可分泌因子抑制成纤维化细胞向激活状态的转化(myofibroblast)，从而抑制肌肉内的疤痕组织的生成。在肌肉干细胞在数量和活性上有缺失时，成纤维化细胞会掌控肌肉再生过程从而导致组织纤维化和疤痕的产生。肌肉干细胞的提取物在体外可促进肌肉干细胞的生长分化，抑制成纤维化细胞，且降低细胞纤维化分化的因子--转化生长因子(TGF-beta1)的表达。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术提供了一种可延缓肌肤衰老、具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法。本专利技术所述技术方案如下：一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法，具体步骤如下：(1)、取新鲜的三角肌组织或受创3-7天内的三角肌，用无菌、无热源的磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗，冲洗后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)、取新鲜的三角肌组织或受创3-7天内的三角肌，用无菌、无热源的磷酸盐缓冲液进行冲洗，冲洗后的三角肌进行组织绞碎，直至组织的颗粒粒径不大于1mm，得到肌肉组织匀浆；/n(2)将肌肉组织匀浆按照酶底物浓度

【技术特征摘要】
1.一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、取新鲜的三角肌组织或受创3-7天内的三角肌，用无菌、无热源的磷酸盐缓冲液进行冲洗，冲洗后的三角肌进行组织绞碎，直至组织的颗粒粒径不大于1mm，得到肌肉组织匀浆；
(2)将肌肉组织匀浆按照酶底物浓度加入胶原酶和中性蛋白酶的混合液来降解消化，得到单个的肌肉干细胞，于37℃下温育1小时，再经灭酶活后得到肌肉组织酶解液；
(3)肌肉组织酶解液通过2000转/分离心得到细胞，再用磷酸缓冲液进行冲洗，再离心得到清洗的细胞，把细胞悬浮于细胞生长培养液，用70微米孔径进行过滤，滤去杂质，通过滤膜的细胞被收集，加入带胶原蛋白铺层的细胞培养板中，用预板培养法分离培养出有活跃再生能力的肌肉干细胞，体外培养的肌肉干细胞每20-22小时增生一倍；
(4)肌肉干细胞用干细胞生长培养液培养至78-82％密集度时，移出培养液，用无菌、无热源的PBS清洗细胞3次，加入无血清培养液继续培养48小时，然后收集无血清培养液；
(5)将收集的无血清培养液进行过滤去处细胞碎片和杂质，然后移入浓缩管中浓缩，再进行冷冻干燥处理，得到冻干粉；未被收集的细胞利用胰酶消化液消化后，用PBS对细胞清洗3次，离心得到细胞团，把细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，置于冰上，用超声细胞破碎仪进行超...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟晓东，
申请(专利权)人：山东卓东生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37