本发明专利技术属于水生态安全领域，具体涉及一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法。本方法通过宏基因组测序技术及组装基因的方法，在基因水平上明确水体中毒性因子的种类和数量，识别其病源宿主信息，从而确定水体中携带毒性因子的病原菌及其潜在的健康风险。该方法具有高通量、快速简便的特点，适用于大规模的采样调查研究。
【技术实现步骤摘要】
一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法
本专利技术涉及一种识别水体中病原菌的方法，具体涉及一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，属于水生态安全领域。
技术介绍
现代的人类生产活动使得河流水环境质量下降，生态功能退化，同时相应的生态健康风险也会逐渐上升。而识别水生态环境中的病原菌是生态健康风险评价的重要内容。通常用于识别检测病原菌的方法有纯培养法和基于PCR技术的分子检测方法。传统纯培养法具有较长的培养周期和复杂的培养条件使得该方法难以应用于大规模的生态调查；基于PCR技术的分子检测方法则严重受限于扩增目的基因引物的特异性，而很难全面识别水体中病原菌的分布。大量的研究表明病原菌的致病性主要依赖于位于其遗传物质内的毒性因子(VFs)，而一种病原菌可以同时携带一种或者多种毒性因子，同时病原菌的致病性与其携带的毒性因子的种类和数量有关。例如：携带进攻型毒性因子的病原菌更容易侵入宿主体内使其感染；而运动型的毒性因子可以使病原菌主动附着在适宜其繁殖的生态位，形成生物膜保护其免受外界攻击。如果能对毒性因子进行识别和溯源，就可以更加全面的评估水体中病原菌的健康风险水平。本专利技术提供一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，用于水环境健康风险的评价。通过宏基因组测序技术及组装基因的方法，对样品中的毒性因子进行检测、分类以及溯源，从而确定环境中携带毒性因子的病原菌及其健康风险水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于宏基因组技术，在基因水平上识别水体中携带毒性因子病原菌的方法。该方法可以提供潜在病原菌的基因信息，以用于环境中微生物健康风险评价。具体方案如下：一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，步骤如下：(1)获取水体待测样本的宏基因组DNA；(2)基因组组装：对所述宏基因组DNA进行拼接组装，依据完整性>50％、污染率<10％，筛选非冗余组装基因组MAGs；(3)毒性因子的识别与分类：采用软件对所述基因组MAGs进行功能基因预测，同时基于病原菌数据库对所述基因组MAGs中的毒性因子进行识别和分类；(4)毒性因子的溯源：当携带所述毒性因子的基因组MAGs的宿主满足与已知病原菌的核酸序列的同源性大于等于80％，且所述基因组MAGs的毒性因子与所述宿主的相似度满足条件：p<0.05,Spearman(斯皮尔曼相关系数)>0.6，则将所述宿主定义为携带毒性因子的病原菌。优选地，所述步骤(1)中，水体待测样本经提取总DNA后，应用Illumina测序平台的HiseqX–Tenpaired-end150bp模式对基因进行扩增和测序；待测试样品下机后，去除嵌合体、去除质量分数≤32或包含>10％的不明确碱基的序列，获得原始宏基因组DNA数据。优选地，所述步骤(1)中，所述水体待测样本通过水体过0.45μm的滤膜获得。优选地，所述步骤(1)中，水体待测样本的总DNA采用试剂盒提取，选用DNeasyPowerWaterKit试剂盒进行提取。所述步骤(1)中，本专利技术主要是基于宏基因组技术对毒性因子进行识别。选择Illumina测序平台的HiseqX–Tenpaired-end150bp模式进行具有以下优点：高通量、速度快、测序周期短和实验成本低。适用于大规模的生态健康风险调查研究。所述步骤(1)中，所述去除嵌合体、去除质量分数≤32或包含>10％的不明确碱基的序列的目的是对进行测序原始数据的质量控制。优选地，所述步骤(2)中，基因组装、筛选过程是利用MEGAHIT软件，软件具体为MEGAHIT(v1.1.3)，对所述宏基因组DNA数据进行拼接组装，联合MetaBAT2，MaxBin2.0和CONCOCT这三种分箱方法，应用MetaWRAP分箱流程对所述宏基因组DNA数据进行筛选。所述步骤(2)中，利用MEGAHIT(v1.1.3)软件对测序数据进行拼接组装得到重叠群，目的是为了高效组装大型和复杂的宏基因组数据，相比于常用SPAdes组装工具效率提高了四倍。所述步骤(2)中，优化并联合MetaBAT2,MaxBin2.0和CONCOCT这三种分箱方法，相比于单独运行可以压缩分箱处理时间，且应用MetaWRAP流程可以提高分箱结果的完整性，降低污染率，在复杂的样品中这种提升更为显著。所述步骤(3)中，所述基因预测的目的是获得编码基因的基本统计信息。优选地，所述步骤(3)中，对于基因组MAGs进行功能基因预测的软件为Prodigal，软件具体为Prodigal(v2.6.3)。优选地，所述步骤(3)中，毒性因子识别的步骤为：使用BLASTP工具将所述基因组MAGs的开放阅读框(ORFs)与所述病原菌数据库中的蛋白序列进行比对，识别相应的毒性因子。更优选地，所述步骤(3)中，毒性因子识别的步骤为：使用BLASTP工具将所述基因组MAGs的开放阅读框(ORFs)与所述VFDB数据库的VFDB_setA_pro中的蛋白序列fas.文件进行比对，识别相应的毒性因子。所述步骤(3)中，用于毒性因子识别的VFDB数据库来源于：http://www.mgc.ac.cn/VFs/download.htm。优选地，所述步骤(3)中，毒性因子分类的步骤为：使用工具GTDB-Tk(v0.3.2)基于病原菌数据库对识别出的毒性因子进行分类。更优选地，所述步骤(3)中，毒性因子分类的步骤为：使用工具为GTDB-Tk，工具具体为GTDB-Tk(v0.3.2)，基于VFDB数据库对识别出的毒性因子进行分类。所述步骤(3)中，用于毒性因子分类的VFDB数据库来源于：http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi。所述步骤(3)中，根据所述VFDB数据库中分类标准与毒性因子的功能，采用工具GTDB-Tk，具体为GTDB-Tk(v0.3.2)软件对将本专利技术的毒性因子分为进攻型、运动型、防御型、免疫型、毒性蛋白和未知型。其主要功能如下：进攻型：携带进攻型毒性因子的病原菌易于侵入宿主体内使其感染；运动型：携带运动型毒性因子的病原菌主动附着在适宜其繁殖的生态位，且大部分都易形成生物膜；防御型：携带防御型毒性因子的病原菌可以抵抗外界环境的刺激，增加其耐药性；免疫型：携带免疫型毒性因子的病原菌可以增强其对宿主免疫反应的耐受性；毒性蛋白：毒性蛋白因子可以调控病原菌分泌特异性毒素攻击宿主不同的组织细胞；未知型：未知型毒性因子尚不明确其具体的作用机制。优选地，所述步骤(4)中，通过fastANI软件，具体为fastANI(v1.1)软件计算携带毒性因子的基因组MAGs的宿主与病原菌数据库中的已知病原菌核酸序列的同源性。优选地，所述步骤(4)中，应用Gephi软件，具体为Gephi(v0.9.2)软件计算基因组MAGs中的毒性因子与携带所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，其特征在于：步骤如下：/n(1)获取水体待测样本的宏基因组DNA；/n(2)对所述宏基因组DNA进行拼接组装，依据完整性>50％、污染率<10％筛选非冗余组装基因组MAGs；/n(3)采用软件对所述基因组MAGs进行功能基因预测，同时基于病原菌数据库对所述基因组MAGs中的毒性因子进行识别和分类；/n(4)当携带所述基因组MAGs的宿主满足与已知病原菌的核酸序列的同源性≥80％，且所述基因组MAGs的毒性因子与所述宿主的相似度满足条件：p<0.05,Spearman>0.6，则将所述宿主定义为携带毒性因子的病原菌。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)获取水体待测样本的宏基因组DNA；
(2)对所述宏基因组DNA进行拼接组装，依据完整性>50％、污染率<10％筛选非冗余组装基因组MAGs；
(3)采用软件对所述基因组MAGs进行功能基因预测，同时基于病原菌数据库对所述基因组MAGs中的毒性因子进行识别和分类；
(4)当携带所述基因组MAGs的宿主满足与已知病原菌的核酸序列的同源性≥80％，且所述基因组MAGs的毒性因子与所述宿主的相似度满足条件：p<0.05,Spearman>0.6，则将所述宿主定义为携带毒性因子的病原菌。
2.如权利要求1所述一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，水体待测样本经提取总DNA后，应用Illumina测序平台的HiseqX–Tenpaired-end150bp模式对基因进行扩增和测序；待测试样品下机后，去除嵌合体、去除质量分数≤32或包含>10％的不明确碱基的序列，获得所述宏基因组DNA。
3.如权利要求1所述一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，基因组装、筛选过程是利用MEGAHIT软件对所述宏基因组DNA进行拼接组装，联合MetaBAT2,MaxBin2.0和CONCOCT这三种分箱方法，应用MetaWRAP分箱流程对所...
【专利技术属性】
技术研发人员：柏耀辉，毛冠男，梁金松，王巧娟，马百文，胡承志，曲久辉，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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