一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，包括以下步骤：S1：人体脂肪组织采集；S2：脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；S3：间充质干细胞的检测和冷冻；S4：间充质干细胞的复苏和大规模扩增；S5：上清液的收集；S6：干细胞活性因子浓缩原液的制备。本发明专利技术提供的生产工艺其能够大规模生产脂肪干细胞活性因子原液，生产效率高，细胞增殖能力强，细胞的旁分泌以及抗凋亡性能显著提高，且细胞旁分泌因子产量高，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺。
技术介绍
脂肪干细胞(adipose-derivedstemcell，ADSCs)目前广泛的应用于再生医学研究领域。相对于骨髓干细胞和脐带干细胞，脂肪干细胞具有原材料丰富，取材方便，细胞旁分泌功能强等优点，特别是其强大的旁分泌功能，人体中大约有800种细胞生长因子，ADSC可以分泌其中的765种，要优于骨髓、脐带等其它间充质干细胞和成体间充质干细胞。脂肪干细胞的优异的旁分泌功能被发现后很快被广泛用于医疗美容业，并且逐步受到其它适应症的青睐。其分泌的细胞活性因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(b-FGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子(PDGF)、干细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素11(IL-11)、干细胞因子(SCF)等，可以诱导细胞的增殖迁移、减缓细胞凋亡、修复损伤组织细胞、促进血管新生、抑制炎症调节机体免疫状态、还可以促进神经干细胞的增殖分化，改善末梢神经功能，其对微环境优异的修复能力可以很好的促进于伤口修复，避免疤痕形成，可广泛的应用于各种护肤品，化妆品以及伤口修复的外用医药产品中。但是现有的脂肪干细胞活性因子浓缩原液由于生产技术的局限和质量管理的混乱，存在最终制备的浓缩原液产量低，浓缩原液中细胞活性因子浓度不高、高盐高糖等缺陷。
技术实现思路
为了解决上述背景技术中存在的问题，本专利技术提供一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，其能够大规模生产脂肪干细胞活性因子原液，生产效率高，细胞活性因子含量高，稳定性好。为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，包括以下步骤：S1：人体脂肪组织采集；S2：脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；S3：间充质干细胞的检测和冷冻；S4：间充质干细胞的复苏和大规模扩增；S5：上清液的收集；S6：干细胞活性因子浓缩原液的制备。进一步地，步骤S4中所述间充质干细胞的复苏具体过程如下：首先将Laminin-521溶液包被的细胞培养瓶放置于37℃培养箱中孵育两个小时以上，用PBS对经过冷冻的细胞进行多次清洗离心，然后将细胞接种到经过孵育的用Laminin-521溶液包被的细胞培养瓶中，次日弃去培养液更换无血清培养基。进一步地，步骤S4中所述大规模扩增具体过程如下：当细胞生长融合达到80％-90％时，用0.125％的Trypsin-EDTA消化液进行消化传代。进一步地，步骤S4中所述传代过程中将经过消化后的细胞进行离心，接种至用Laminin-521溶液包被的多层细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中进行传代培养，直至细胞生长融合达到80％-90％。进一步地，步骤S5中所述上清液的收集具体过程如下：将P3-P8代次细胞接种到用Laminin-521溶液包被的多层细胞培养瓶中，细胞接种后在21％O2，5％CO2，74％N2的气体浓度下培养8小时后，然后将氧气浓度逐步降低至10％继续培养8小时，再次将氧气浓度逐步降低至5％继续培养8小时后，此时细胞生长融合为90％，回收上清液置于4℃条件下保存，更换旁分泌专用培养基并将氧气浓度降低至2％继续培养24小时，此后每隔24小时对上清液进行收集，并更换一次新鲜旁分泌专用培养基。进一步地，步骤S5中对收集得到的上清液依次经过0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片，再经过0.22μm滤膜过滤灭菌。进一步地，所述旁分泌专用培养基为在无血清培养基的基础上添加硫代甘油2-4mg/mL、吡哆醇盐酸盐0.5-0.8mol/mL、辅酶A5-10ng/mL、辅羟酶2-8ng/mL。进一步地，步骤S6中所述干细胞活性因子浓缩原液的制备过程如下：首先对收集得到的上清液进行无菌检测、支原体检测、内毒素检测、蛋白浓度以及关键细胞因子浓度检测，然后将检验合格的上清液通过100KDa滤膜的超浓缩杯加压浓缩，浓缩后得到的脂肪干细胞活性因子浓缩原液置于-80℃条件下保存。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术所提供的脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，通过在细胞低氧培养不同阶段对氧气含量进行调整，实现了细胞的快速扩增，细胞抗凋亡性显著增强，有效的促进细胞旁分泌性能，收集的上清液中细胞活性因子含量高，稳定性好；其配合采用旁分泌专用培养基在维持细胞生长状态的同时诱导细胞分泌处更多的细胞活性因子；在干细胞活性因子浓缩原液的制备过程中，收集得到的上清液经过100KDa滤膜的超浓缩杯加压浓缩，去除液体中的高盐高糖等多余成分的同时可以最大程度的保留有效细胞活性因子蛋白成分。本专利技术提供的生产工艺其能够大规模生产脂肪干细胞活性因子原液，生产效率高，细胞增殖能力强，细胞的旁分泌以及抗凋亡性能显著提高，细胞活性因子含量高，稳定性好。具体实施方式实施例1一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，包括以下步骤：S1：人体脂肪组织采集对供者进行HIV、HBV、HCV体检，然后在局部麻醉的状态下，采用肿胀法吸脂术获取脂肪，最大负压为430mmHg，采集部位为大腿部，获取的脂肪经过500μm过滤孔过滤出油脂和水分，得到呈淡黄色脂肪。S2：脂肪干细胞的原代分离、培养和传代将得到的脂肪进行预处理，用PBS液进行多次清洗，直至清洗液为清澈透亮，脂肪呈现干净的淡黄色；经上述经过多次清洗后的脂肪置于与脂肪等体积的0.2％-0.4％的I型胶原蛋白酶和VI型胶原蛋白酶的混合液中，在37℃的温度下均匀震荡消化30-40分钟，随后向其中加入三分之一体积的0.25％的Trypsin-EDTA消化液(终浓度为0.0625％)，在37℃的温度下均匀震荡消化10-15分钟后，加入胰蛋白酶抑制剂混合均匀终止消化；随后将其用900g的转速离心10分钟后，吸弃上层混合液，用PBS清洗底层细胞，并通过100目筛网过滤；将滤液用210g的转速离心10分钟，吸弃上清液，去除未消化纤维组织和杂质，得到原代脂肪干细胞。将原代脂肪干细胞加入到无血清培养基重悬，进行细胞计数后，按大于3×104/cm2的密度接种到使用层粘连蛋白Laminin-521溶液包被的细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养2天后，弃去培养液更换新鲜无血清培养基，将细胞培养瓶于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，每两天更换一次新鲜无血清培养基；当脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，用Trypsin-EDTA消化液进行消化，按照1:3的比例进行传代，得到大量脂肪干细胞；其中，无血清培养基包括如下组分：α-MEM、20％人源血小板裂解液、105U/LIF(白细胞抑制因子)、5-10ng/mLb-FGF(碱性成纤维生长因子)、5-10ng/mLTGF-β(转化生长因子-β)和500-1000IU/L肝素钠，TGF-β和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：人体脂肪组织采集；/nS2：脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；/nS3：间充质干细胞的检测和冷冻；/nS4：间充质干细胞的复苏和大规模扩增；/nS5：上清液的收集；/nS6：干细胞活性因子浓缩原液的制备。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1：人体脂肪组织采集；
S2：脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；
S3：间充质干细胞的检测和冷冻；
S4：间充质干细胞的复苏和大规模扩增；
S5：上清液的收集；
S6：干细胞活性因子浓缩原液的制备。


2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，其特征在于，步骤S4中所述间充质干细胞的复苏具体过程如下：首先将Laminin-521溶液包被的细胞培养瓶放置于37℃培养箱中孵育两个小时以上，用PBS对经过冷冻的细胞进行多次清洗离心，然后将细胞接种到经过孵育的用Laminin-521溶液包被的细胞培养瓶中，次日弃去培养液更换无血清培养基。


3.根据权利要求2所述的脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，其特征在于，步骤S4中所述大规模扩增具体过程如下：当细胞生长融合达到80％-90％时，用0.125％的Trypsin-EDTA消化液进行消化传代。


4.根据权利要求3所述的脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，其特征在于，步骤S4中所述传代过程中将经过消化后的细胞进行离心，接种至用Laminin-521溶液包被的多层细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中进行传代培养，直至细胞生长融合达到80％-90％。


5.根据权利要求1所述的脂肪干细胞活性因子浓缩原液的生产工艺，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐健，韩瑛璐，罗德胜，
申请(专利权)人：成熙上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31