测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，首先建立斑马鱼氧化损伤模型；然后对氧化损伤后的斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼测定SOD活性、丙二醛含量，判定斑马鱼氧化损伤强弱；测定氧化损伤后的斑马鱼体内氧化损伤的主要指标，包括ROS生成水平、脂质过氧化程度与细胞凋亡程度；最后在建立斑马鱼氧化损伤模型的人工海水培养基中加入紫色马铃薯提取物花青素溶液，对斑马鱼进行氧化损伤修复，测定紫色马铃薯提取物花青素溶液对斑马鱼氧化损伤修复功能的强弱。本发明专利技术中的测定方法能够准确的测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复的程度，可应用于实际的斑马鱼体内氧化损伤的修复。

【技术实现步骤摘要】
测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法
本专利技术涉及斑马鱼体内氧化损伤修复
，尤其涉及测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法。
技术介绍
正常情况下，动物机体存在氧化和抗氧化的动态平衡，即体内自由基的产生和清除保持着动态平衡。但当机体处于一定特殊环境时，如食物成分改变、放射性照射、重金属暴露、细菌性和病毒性感染、感情和情绪不稳定等均可导致机体处于氧化应激状态。花青素(Anthocyanins)是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，属于类黄酮化合物，是一种强有力的抗氧化剂，它能够保护人体免受自由基一类有害物质的损伤，在预防DNA裂解、雌激素活性、酶抑制、促进生产因子等调节免疫反应方面以及在抗炎活性，脂质过氧化作用，加固细胞膜等方面都具有一定功能。但是不同植物的提取物花青素对于动物体内氧化损伤修复能力也是不同的，紫色马铃薯提取物花青素是否能够对动物机体进行氧化损伤修复，以及紫色马铃薯提取物花青素对不同动物机体的氧化损伤修复的程度都需要预先进行测定，然后才能进行实际的应用。目前国内外并没有评价氧化损伤程度的具体指标。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供一种可以用来测定紫色马铃薯花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，该方法中提出了一套用来评价氧化损伤程度的指标。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，其特征在于，包括以下步骤，>S1：分别建立斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼的氧化损伤模型，并相应的设置空白对照组进行对比；S2：利用超氧化物歧化酶活力测定试剂盒、丙二醛含量测定试剂盒对斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼测定SOD酶活性、丙二醛含量，判定氧化损伤后的斑马鱼体内氧化损伤程度；S3：测定斑马鱼体内氧化损伤的主要指标，包括ROS生成水平、脂质过氧化程度与细胞凋亡程度；S4：在建立斑马鱼氧化损伤模型的人工海水培养基中加入15～50mg/L紫色马铃薯提取物花青素溶液，对斑马鱼进行氧化损伤修复；S5：检测氧化损伤修复后的斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼体内SOD活性、丙二醛含量及ROS生成水平、脂质过氧化程度与细胞凋亡程度，判定紫色马铃薯提取物花青素溶液对斑马鱼氧化损伤修复的程度。进一步的，步骤S1建立斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼的氧化损伤模型具体操作步骤包括，S11：将7-8hpf斑马鱼胚胎和4dpf斑马鱼幼鱼随机分为空白对照组和脂多糖处理组，放入12孔培养板中，用2.5ppmLPS对脂多糖处理组的斑马鱼7-8hpf胚胎和4dpf幼鱼分别氧化胁迫14h和24h后，用新鲜人工海水培养基清洗并重悬；S12：将4mpf斑马鱼成鱼随机分为空白对照组和脂多糖处理组，用0.1ppmLPS对脂多糖处理组的斑马鱼4mpf成鱼暴露处理7d后，用新鲜人工海水培养基清洗并重悬。进一步的，步骤S2中SOD酶活性测定的具体操作步骤包括：将斑马鱼胚胎、幼鱼加入生理盐水制成匀浆，加入酶作用底物和缓冲溶液，37℃温育20min后，于酶标仪450nm波长处测定SOD酶活性；将斑马鱼成鱼断尾取血，血液室温放置4h后吸取上层黄色上清，加入酶作用底物和缓冲溶液，37℃温育20min后，于酶标仪450nm波长处测定SOD酶活性。进一步的，步骤S2中丙二醛含量测定的具体操作步骤包括：将斑马鱼胚胎、幼鱼加入丙二醛提取液制成匀浆，95℃温育40min后，于酶标仪530nm波长处测定丙二醛含量；切取斑马鱼成鱼肝脏，加入丙二醛提取液匀浆后，95℃温育40min，于酶标仪530nm波长处测定丙二醛含量。进一步的，步骤S3中利用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐探针测定斑马鱼体内ROS生成水平。进一步的，利用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐探针测定斑马鱼体内ROS生成水平的具体操作包括：取空白对照组以及氧化损伤后的斑马鱼，分别用20μg/mL的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐处理，黑暗28.5℃下培养1h，1h后用人工海水淋洗数次，用0.02％三卡因麻醉后置于荧光显微镜下拍照，并计算其荧光强度。进一步的，步骤S3中利用1,3-双(二苯膦)丙烷探针测定斑马鱼体内脂质过氧化程度。进一步的，利用1,3-双(二苯膦)丙烷探针测定斑马鱼体内脂质过氧化程度的具体操作步骤包括：取空白对照组以及氧化损伤后的斑马鱼，分别用25μg/mL的1,3-双(二苯膦)丙烷处理，黑暗28.5℃下培养1h，1h后用人工海水淋洗数次，用0.02％三卡因麻醉后置于荧光显微镜下拍照，于荧光显微镜下拍照，并计算荧光强度。进一步的，步骤S3中利用吖啶橙探针测定斑马鱼体内细胞凋亡程度。进一步的，利用吖啶橙探针测定氧化损伤后的斑马鱼体内细胞凋亡程度的具体操作步骤包括：取取空白对照组以及氧化损伤后的斑马鱼，分别用2.5μg/mL的吖啶橙处理，黑暗28.5℃培养30min，之后以人工海水淋洗数次，用0.02％三卡因麻醉后置于荧光显微镜下拍照，接着于荧光显微镜下拍照，并计算荧光强度。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术通过建立斑马鱼氧化损伤模型，能够完整、快速的检测出紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤的修复程度，并有望推广到其它来源花青素的测定。2、本专利技术中测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法中提出了一套可以用来评价氧化损伤程度的指标，包括SOD酶活性、丙二醛、ROS生成水平、脂质过氧化程度和细胞凋亡程度，可以作为具体的评价指标用在其他的氧化损伤程度评价中。附图说明图1为本专利技术LPS处理对斑马鱼胚胎和幼鱼SOD酶活性影响结果柱状图；图2为本专利技术LPS处理对斑马鱼成鱼SOD酶活性影响结果柱状图；图3为本专利技术LPS处理对斑马鱼胚胎和幼鱼丙二醛含量影响结果柱状图；图4为本专利技术LPS处理对斑马鱼成鱼丙二醛含量影响结果柱状图；图5为本专利技术利用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐探针测定氧化损伤后的斑马鱼胚胎和幼鱼体内ROS生成水平时的荧光显微成像图；图6为本专利技术LPS处理对斑马鱼胚胎和幼鱼ROS生成水平影响结果柱状图；图7为本专利技术利用1,3-双(二苯膦)丙烷探针测定氧化损伤后的斑马鱼胚胎和幼鱼体内脂质过氧化程度时的荧光显微成像图；图8为本专利技术LPS处理对斑马鱼胚胎和幼鱼脂质过氧化程度影响结果柱状图；图9为本专利技术利用吖啶橙探针测定氧化损伤后的斑马鱼胚胎和幼鱼体内细胞凋亡程度时的荧光显微成像图；图10为本专利技术LPS处理对斑马鱼胚胎和幼鱼细胞凋亡程度影响结果柱状图。具体实施方式为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案做进一步的描述。测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，包括以下步骤，S1：建立斑马鱼氧化损伤模型；具体的，将7-8hpf(受精后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，其特征在于，包括以下步骤，/nS1：分别建立斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼的氧化损伤模型，并相应的设置空白对照组进行对比；/nS2：利用超氧化物歧化酶活力测定试剂盒、丙二醛含量测定试剂盒对斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼测定SOD酶活性、丙二醛含量，判定氧化损伤后的斑马鱼体内氧化损伤程度；/nS3：测定斑马鱼体内氧化损伤的主要指标，包括ROS生成水平、脂质过氧化程度与细胞凋亡程度；/nS4：在建立斑马鱼氧化损伤模型的人工海水培养基中加入15～50mg/L紫色马铃薯提取物花青素溶液，对斑马鱼进行氧化损伤修复；/nS5：检测氧化损伤修复后的斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼体内SOD活性、丙二醛含量及ROS生成水平、脂质过氧化程度与细胞凋亡程度，判定紫色马铃薯提取物花青素溶液对斑马鱼氧化损伤修复的程度。/n

【技术特征摘要】
1.测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：分别建立斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼的氧化损伤模型，并相应的设置空白对照组进行对比；
S2：利用超氧化物歧化酶活力测定试剂盒、丙二醛含量测定试剂盒对斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼测定SOD酶活性、丙二醛含量，判定氧化损伤后的斑马鱼体内氧化损伤程度；
S3：测定斑马鱼体内氧化损伤的主要指标，包括ROS生成水平、脂质过氧化程度与细胞凋亡程度；
S4：在建立斑马鱼氧化损伤模型的人工海水培养基中加入15～50mg/L紫色马铃薯提取物花青素溶液，对斑马鱼进行氧化损伤修复；
S5：检测氧化损伤修复后的斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼体内SOD活性、丙二醛含量及ROS生成水平、脂质过氧化程度与细胞凋亡程度，判定紫色马铃薯提取物花青素溶液对斑马鱼氧化损伤修复的程度。


2.根据权利要求1所述的测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，其特征在于：步骤S1建立斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼的氧化损伤模型具体操作步骤包括，
S11：将7-8hpf斑马鱼胚胎和4dpf斑马鱼幼鱼随机分为空白对照组和脂多糖处理组，放入12孔培养板中，用2.5ppmLPS对脂多糖处理组的斑马鱼7-8hpf胚胎和4dpf幼鱼分别氧化胁迫14h和24h后，用新鲜人工海水培养基清洗并重悬；
S12：将4mpf斑马鱼成鱼随机分为空白对照组和脂多糖处理组，用0.1ppmLPS对脂多糖处理组的斑马鱼4mpf成鱼暴露处理7d后，用新鲜人工海水培养基清洗并重悬。


3.根据权利要求2所述的测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，其特征在于，步骤S2中SOD酶活性测定的具体操作步骤包括：将斑马鱼胚胎、幼鱼加入生理盐水制成匀浆，加入酶作用底物和缓冲溶液，37℃温育20min后，于酶标仪450nm波长处测定SOD酶活性；
将斑马鱼成鱼断尾取血，血液室温放置4h后吸取上层黄色上清，加入酶作用底物和缓冲溶液，37℃温育20min后，于酶标仪450nm波长处测定SOD酶活性。


4.根据权利要求2所述的测定紫色马铃薯提取物花青素对斑马鱼体内氧化损伤修复程度的方法，其特征在于，步骤S2中丙二醛含量测定的具体操作步骤包括：将斑马鱼胚胎、幼...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩岚，冯雪，王玲娜，张金然，冯永淼，
申请(专利权)人：呼和浩特职业学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15