一种肿瘤细胞三维模型的建立方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种肿瘤细胞三维模型的建立方法和应用，建立方法步骤如下：(1)制备富血小板纤维蛋白粉末，无菌保存；(2)制备富血小板纤维蛋白粉末‑生物活性材料复合多孔微球，无菌保存；(3)将肿瘤单细胞与复合多孔微球共培养得到肿瘤细胞三维模型；生物活性材料开始发生降解的时间小于共培养的时间；应用为：将肿瘤细胞三维模型用作抗肿瘤药物筛选模型或用于建立小鼠肿瘤病理模型。本发明专利技术的建立方法简单，对肿瘤细胞外基质等肿瘤微环境有极好的成分模拟，可快速、高通量地进行抗肿瘤药物的药效评价，极大提升临床前预测效能，易于推广。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤细胞三维模型的建立方法和应用
本专利技术属于肿瘤细胞三维培养领域，具体涉及一种肿瘤细胞三维模型的建立方法和应用。
技术介绍
晚期肿瘤患者的抗肿瘤药物抵抗导致癌症死亡率居高不下。因此，新型抗肿瘤药物的开发对于提升患者生存至关重要。而新型抗肿瘤药物的快速和有效筛选依赖于更具预测性的临床前研究模型，并对筛选获得的药物进行后续动物实验和人体临床试验，提升研究和临床转化效率。肿瘤微环境在调控肿瘤发生、进展和转移中起主导作用，肿瘤细胞与周围环境的高度动态相互作用表明，在生物材料支架中研究肿瘤可能比传统单层组织培养模型更仿真可靠，有助于分子通路与新型治疗靶点的研究与探索。回顾既往研究，在各种平面基板上培养的二维(2D)单层细胞是筛选药物的便捷有效方法。而目前研究表明，在药物进入动物模型研究或临床试验之前，使用三维(3D)细胞培养体系以及更好的细胞模型(例如干细胞和原代细胞)可以提高药物作用和毒性的可预测性，同时会降低正在开发的新药物的损耗率。研究表明，三维培养后的肿瘤细胞团更接近体内肿瘤组织的生长状态，在基因表达、耐药性及粘附生长方面明显不同于传统平面培养的细胞。构建肿瘤多细胞球体模型是一种目前常用的体外三维培养模型，常用来形成多细胞球体的技术有悬浮培养法、微流控法、外加离心力法、重力法及微球培养法。悬浮培养成团率低，微流控法、外加离心力法、重力法均会对肿瘤细胞产生剪切力，因此微球培养法已成为一种优选的制备肿瘤多细胞团的技术。专利CN201910789298.1介绍了一种表面具有微拓扑结构的可降解微球，采用乳化法制备了表面具有凹陷或褶皱结构的椭圆微球，该专利所述的微球粒径为1～600微米，具有良好的生物相容性且细胞能在微球表面粘附、生长，但该微球降解时间过长(3个月的降解残存率仍为85％～98％)，不适于进行肿瘤细胞的三维培养；专利CN201510072086.3介绍了一种三维复合微球，采用天然或化学合成聚合物制备亚微米级微球，并以人E-钙粘素修饰微球，制备出表面改性E-钙粘素介导的生物材料微球，该专利所述的微球可通过钙粘素和黏着连接信号分子促进微球与细胞共培养形成微球/干细胞复合微球，用于干细胞三维状态下增殖、分化的研究，但是该种方法制备微球采用的蛋白融合及修饰方法较为复杂，且E-钙粘素只存在于微球表面，不能与微球内部细胞进行作用，在培养细胞时需要借助悬滴或离心等方法，这些过程会对细胞造成一定损伤；专利CN201910133058.6介绍了一种载细胞海藻酸盐凝胶微球，采用基质材料为天然高分子材料海藻酸盐溶液与二价金属离子进行螯合反应制备水凝胶，其中凝胶体系为粒径100～2000微米的球形胶珠，该专利所述的微球可使细胞呈现三维立体生长方式，且比动物模型更为经济，但是该微球缺少维持细胞活性的生物因子，在包埋细胞时存在细胞活性不稳定、肿瘤细胞成团性较差等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种肿瘤细胞三维模型的建立方法和应用。本专利技术利用天然材料富血小板纤维蛋白粉末(PRF)及可降解生物活性材料制备成多孔、可降解且具有生物活性成分的复合多孔微球，通过对肿瘤细胞的三维培养形成肿瘤多细胞球体，与单一使用生物活性材料的支架相比，可快速建立肿瘤细胞三维培养模型并维持肿瘤细胞活性。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，步骤如下：(1)制备富血小板纤维蛋白粉末，无菌保存；(2)制备富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球，无菌保存；(3)将肿瘤单细胞与富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球共培养得到肿瘤细胞三维模型，在此过程中，生物活性材料逐渐降解，肿瘤细胞会不断分泌新的胶原蛋白，逐渐形成肿瘤多细胞球体，在这个肿瘤多细胞球体内，仅有少量的微球物质残留，但一个微球可形成多个肿瘤多细胞球体；共培养结束时生物活性材料的降解率为30～99％。本专利技术建立肿瘤细胞三维模型的过程中制备微球采用的原料为富血小板纤维蛋白粉末和生物活性材料，且共培养结束时生物活性材料的降解率为30～99％，使得肿瘤细胞生长过程中不受阻于材料的限制能够形成多细胞球体，有效解决了现有技术中存在的微球降解时间过长不适于进行肿瘤细胞的三维培养的问题；本专利技术建立肿瘤细胞三维模型的过程中制备微球采用的原料为富血小板纤维蛋白粉末和生物活性材料，富血小板纤维蛋白(PRF)粉末具有多种生长因子，主要包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、转化生长因子-β2(TGF-β2)、表皮样生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等，血液中还存在三种蛋白质：纤维素、纤连蛋白及玻粘连蛋白，这些生长因子和蛋白质都能促进肿瘤细胞的增殖与血管化，有效解决了现有技术中存在的微球缺少维持细胞活性的生物因子，在包埋细胞时存在细胞活性不稳定、肿瘤细胞成团性较差的问题，同时本专利技术制备微球采用的方法为小孔挤出法、静电液滴法、微流控法或乳化法，富血小板纤维蛋白粉末能够均匀分散在微球内外，在进行细胞培养时，细胞不仅能与微球表面的生长因子接触，还能进入微球内部与微球内部的生长因子接触，有利于肿瘤细胞的增殖，有效解决了现有技术中存在的生长因子只存在于微球表面不能与微球内部细胞进行作用的问题。作为优选的技术方案：如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，富血小板纤维蛋白粉末的制备过程为：按需采取适量静脉血，置于无菌离心管中，迅速以2000～4000r/min的转速离心10～30min(转速和离心时间过低会影响提取PRF的效率，过高会对PRF产生一定的破坏效果包括PRF的三维微结构和所含生长因子的量)，静置1～4h(静置时间过短PRF还没有完全交联在一起，此时取凝胶层制备颗粒会损失部分PRF)后取凝固物中间黄色凝胶层制成颗粒，-20～4℃储藏备用。如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，富血小板纤维蛋白粉末的平均直径为200～1000微米。如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球的平均直径为200～2000微米，表面具有凹陷或贯穿孔洞，平均孔径为10～40微米，孔隙率为40％～70％。如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，制备富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球是指采用小孔挤出法、静电液滴法、微流控法或乳化法将分散有富血小板纤维蛋白粉末的生物活性材料溶液制成富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球，生物活性材料溶液的浓度为0.25～2wt％(浓度过高制备的微球孔隙率过低，不利于肿瘤细胞向微球内部生长；浓度过低导致混合溶液粘度不高，不利于制备多孔微球)，生物活性材料溶液的体积与制备富血小板纤维蛋白粉末采用的静脉血的体积之比为1:5～20。如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，共培养的过程为：将平面培养的肿瘤细胞消化重悬得到肿瘤单细胞悬浮液后，采用注射器或移液枪将肿瘤单细胞悬浮液植入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征是，步骤如下：/n(1)制备富血小板纤维蛋白粉末，无菌保存；/n(2)制备富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球，无菌保存；/n(3)将肿瘤单细胞与富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球共培养得到肿瘤细胞三维模型；/n共培养结束时生物活性材料的降解率为30～99％。/n

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征是，步骤如下：
(1)制备富血小板纤维蛋白粉末，无菌保存；
(2)制备富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球，无菌保存；
(3)将肿瘤单细胞与富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球共培养得到肿瘤细胞三维模型；
共培养结束时生物活性材料的降解率为30～99％。


2.根据权利要求1所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于，富血小板纤维蛋白粉末的制备过程为：按需采取适量静脉血，置于无菌离心管中，迅速以2000～4000r/min的转速离心10～30min，静置1～4h后取凝固物中间黄色凝胶层制成颗粒，-20～4℃储藏备用。


3.根据权利要求2所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于，富血小板纤维蛋白粉末的平均直径为200～1000微米。


4.根据权利要求3所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于，富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球的平均直径为200～2000微米，平均孔径为10～40微米，孔隙率为40％～70％。


5.根据权利要求4所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于，制备富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球是指采用小孔挤出法、静电液滴法、微流控法或乳化法将分散有富血小板纤维蛋白粉末的生物活性材料溶液制成富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球，生物活性材料溶液的浓度为0.25～2wt％，生物活性材料溶液的体积与制备富血小板纤维蛋白粉末采用的静脉血的体积之比为1:5～20...

【专利技术属性】
技术研发人员：李超婧，刘星星，胡梦博，徐晨阳，王富军，王璐，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31