非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂和试剂盒，设计出一对序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的上游引物、下游引物，SEQ ID No.4所示的核苷酸序列作为探针，探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。本发明专利技术构建的序列为SEQ ID NO：1的阳性质粒，作为实时荧光定量PCR反应的阳性质控；阳性质粒稀释10

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂和试剂盒
本专利技术属于生物检测
，涉及一种PCR检测试剂和试剂盒，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂和试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟（AfricanSwinefever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（AfricanSwinefevervirus，ASFV）感染家猪和各种野猪（非洲野猪、欧洲野猪等）引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物传染病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，临床表现为发热（达40～42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，非洲猪瘟病毒能从被感染猪只血液、组织液、内脏，及其他排泄物中依靠实验室监测证实出来。OIE推荐检测非洲猪瘟的方法为聚合酶链式反应（PCR），我国标准检测非洲猪瘟的方法主要PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）。现有检测方法均存在时间长、灵敏度低等缺陷。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高的检测试剂和试剂盒。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的部分目标片段（170bp）作为靶目标，包括：上游引物为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；下游引物为SEQIDNO：3所示的核苷酸序列；探针为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。其中探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。截取非洲猪瘟E75毒株（Genebank:FN557520.1）VP72基因170bp作为目标片段，扩增目标核苷酸序列为SEQIDNO：4所示。一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，包括荧光PCR反应液、样品裂解液、阳性对照、阴性对照。一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，还可包括无菌生理盐水。其中，所述荧光PCR反应液中包含：上游引物为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；下游引物为SEQIDNO：3所示的核苷酸序列；探针为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；阳性对照为包括SEQIDNO：1所示序列的质粒。其中探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。其中，所述阳性对照为将阳性质粒稀释106倍。其中，所述阴性对照为SPF猪血清。其中所述样品裂解液为1×TE（pH8.0）。其中1×TE（pH8.0）配制包括如下步骤：（1）1MTris-HCL（pH8.0）的配制：称取Tris碱6.06g，加超纯水40mL溶解，滴加浓HCL约2.1mL调节pH至8.0，定容至50mL。（2）0.5MEDTA（pH8.0）的配制：称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加超纯水35mL，剧烈搅拌，用约1g的强氧化钠颗粒调节pH至8.0，定容至50mL（EDTA-Na2·2H2O需加入强氧化钠调节pH至8.0时才能溶解）。（3）1×TE（pH8.0）的配制：1MTris-HCL（pH8.0）1mL，0.5MEDTA（pH8.0）2mL，加超纯水定容100mL。本专利技术获得的非洲猪瘟实时荧光PCR检测试剂盒是基于在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过软件对未知模板进行计算分析的方法，具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点。具体实施方式为对本专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本专利技术的具体实施方式。非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂的制备1.1引物和探针的设计根据非洲猪瘟E75毒株（Genebank:FN557520.1）VP72基因设计一对特异性引物和Taqman探针，Taqman探针选择FAM报告基因和BQ1淬灭基因，扩增区域长度为170bp，设计出一对引物序列为SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和序列为SEQIDNo.4所示的探针，上下游引物和Taqman探针由金斯瑞生物科技有限公司合成。上游引物为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列：5’GACCACTGGGTTGGTATT3’下游引物为SEQIDNO：3所示的核苷酸序列：5’TTCCGTAACTGCTCAT3’探针为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列：FAM-5’CATCGCACCCGGATCATCGG3’-BQ1。阳性质粒的制备ASFV-VP72基因由金斯瑞生物科技有限公司合成，并直接克隆到克隆载体pMD18T。本产品中VP72基因截取非洲猪瘟E75毒株（Genebank:FN557520.1）VP72基因170bp作为目标片段，质粒序列为SEQIDNO：1：GACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATCGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTATCGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAA浓度大小为2ng/μL。针对ASFV的PCR检测试剂盒的建立2.1检测试剂盒的组分检测试剂盒的包括荧光PCR反应液、样品裂解液、阳性对照、阴性对照、无菌生理盐水。所述荧光PCR反应液中包含：具体实施方式步骤1.1获得的引物和探针；；所述阴性对照为SPF猪血清；所述样品裂解液为1×TE（pH8.0）。样品裂解液的制备（1）1MTris-HCL（pH8.0）的配制：称取Tris碱6.06g，加超纯水40mL溶解，滴加浓HCL约2.1mL调节pH至8.0，定容至50mL。（2）0.5MEDTA（pH8.0）的配制：称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加超纯水35mL，剧烈搅拌，用约1g的强氧化钠颗粒调节pH至8.0，定容至50mL（EDTA-Na2·2H2O需加入强氧化钠调节pH至8.0时才能溶解）。（3）1×TE（pH8.0）的配制：1MTris-HCL（pH8.0）1mL，0.5MEDTA（pH8.0）2mL，加超纯水定容100mL。实时荧光PCR退火延伸温度的优化在57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为25μL，反应程序为95℃3min预本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包括以下引物和与引物配合使用的探针：引物对序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的上游引物、下游引物，探针核苷酸序列为SEQ ID No .4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包括以下引物和与引物配合使用的探针：引物对序列分别为SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示的上游引物、下游引物，探针核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。


2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，其中探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。


3.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂是以非洲猪瘟E75毒株VP72基因170bp作为目标片段的，扩增目标核苷酸序列为SEQIDNO：1所示序列。


4.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的PCR检测试剂。


...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘河冰，温凯，刘薇，于占美，杨柳，李蓉蓉，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11