【技术实现步骤摘要】
一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获及检测方法
本专利技术涉及生物与医学检测
，尤其涉及到一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获及检测方法。
技术介绍
肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90％，HCC的发病率约为每年10.1例/10万人，每年因HCC而死亡的病例超过60万例，是目前世界第六大恶性肿瘤，在肿瘤死因中排名第二，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。流行病学统计调查显示，在亚洲地区的HCC与乙肝病毒感染具有密切联系。此外，丙肝病毒、肝硬化、过度酗酒以及黄曲霉素的摄入都是HCC的高危因素。HCC的发生是一个多阶段、多因素的协同作用，经过启动、促癌和演进等过程以及多个癌基因和相关基因参与的结果。由于HCC潜伏期长、增殖极为迅速，使得早期的诊断和治疗受到了极大的限制。近年来，随着一些肝癌生物学标志物的发现，使得人类对肝癌发生、发展的认识有了长足的进步，磷脂酰基醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3)是Glypican家族的一员，属膜性(memb...
【技术保护点】
1.一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)采集血样：取来自肝细胞癌患者的外周血置于抗凝离心管中并混匀全血标本；/n(2)对血样进行前置处理：对步骤(1)中的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的处理；/n(3)洗涤磁微粒：吸取适量结合了GPC3抗体的磁微粒混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清，重复3次后用缓冲液重悬GPC3磁微粒至原体积；/n(4)抗体孵育：将结合了GPC3抗体的磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的血样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30mi...
【技术特征摘要】
1.一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)采集血样：取来自肝细胞癌患者的外周血置于抗凝离心管中并混匀全血标本；
(2)对血样进行前置处理：对步骤(1)中的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的处理；
(3)洗涤磁微粒：吸取适量结合了GPC3抗体的磁微粒混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清，重复3次后用缓冲液重悬GPC3磁微粒至原体积；
(4)抗体孵育：将结合了GPC3抗体的磁微粒缓慢加入步骤(2)中处理好的血样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动30min，每10min混匀一次；
(5)分离捕获CTC：将步骤(4)中的液体转移至一支新的抗凝离心管中，靠于磁力架上，捕获CTC的磁珠会吸附在磁力架一侧，倒置磁力架和抗凝离心管，洗下离心管盖上的样本；
(6)静置10分钟后，吸弃澄清液，随后加1mLddH2O清洗磁球；
(7)加100uLCF1进行涂片，在37℃条件下烘干；
(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，在装有2×SSC的37℃的水浴锅中预热10min；
(9)分别选用75％、85％和无水乙醇进行脱水，分别进行2min，并在室温下风干；
(10)加10uL荧光探针并封片，置于杂交仪中76℃杂交10min，37℃杂交1.5h；
(11)用镊子撕去封片胶，放入43℃的甲酰胺中，脱落盖玻片，浸洗10min，再采用2×SSC浸洗15min，并每5min摇晃一次；
(12)在样本区涂100uL的CK荧光抗体染色液，37℃湿盒避光条件下孵育1h；
(13)洗弃CK荧光抗体染色液，用0.2％BSA洗两次后，加10uLDAPI盖片读片。
2.根据权利要求1所述的一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获方法，其特征在于：所述步骤(4)中，具体为取10uL结合了GPC3抗体的磁微粒至于7.5mL的样品中混匀。
3.根据权利要求1所述的一种肝细胞癌血清中CTC的分离捕获方法，其特征在于：所述步骤(2)中血样前置处理的具体步骤为：
...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁晓飞，易滨，武田，汪新燕，刘林春，
申请(专利权)人：梁晓飞，易滨，
类型：发明
国别省市：上海;31
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