【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】昆虫中的核酸内切酶定性和绝育相关申请的交叉引用本申请要求2017年11月21日提交的，题目为“NovelSterileInsectTechnique”的美国临时申请系列号62/589,405的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文。关于联邦资助的研究和开发的声明本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的基金号5K22AI113060和1R21AI123937以及国防部高级研究计划局授予的基金号HR0011-17-2-0047的政府支持下进行的。政府享有本专利技术的某些权利。
技术介绍
被称为昆虫不育技术(SIT)的不育雄性的大规模生产和释放在历史上一直被用来控制和根除害虫种群，这可追溯到二十世纪三十年代中期。先前的方法依靠DNA破坏剂进行不育，基本上降低了释放的雄性的整体健康度(fitness)和交配竞争力。为了克服这些问题，已经开发了微生物介导的不育技术比如基于沃尔巴克氏菌的昆虫不相容技术(IIT)和现代遗传SIT样系统比如携带显性致死基因的昆虫的释放(昆虫显性致死释放技术，ReleaseofInsectscarrying...
【技术保护点】
1.一种在基因修饰的昆虫的后代中指导雄性定性的方法，所述方法包括：/n将至少一个核酸序列整合到第一昆虫的基因组中，所述至少一个核酸序列包括至少一个第一引导多核苷酸，所述第一引导多核苷酸靶向雌性特异性生存力所必需的雌性必要的基因组序列；/n将核酸内切酶引入第二昆虫内，所述第二昆虫能够与所述第一昆虫遗传杂交；和/n将所述第一昆虫和所述第二昆虫遗传杂交，从而产生包括所述核酸内切酶和所述至少一个核酸序列的后代，来自所述后代的雄性昆虫卵成熟至成年。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171121 US 62/589,4051.一种在基因修饰的昆虫的后代中指导雄性定性的方法，所述方法包括：
将至少一个核酸序列整合到第一昆虫的基因组中，所述至少一个核酸序列包括至少一个第一引导多核苷酸，所述第一引导多核苷酸靶向雌性特异性生存力所必需的雌性必要的基因组序列；
将核酸内切酶引入第二昆虫内，所述第二昆虫能够与所述第一昆虫遗传杂交；和
将所述第一昆虫和所述第二昆虫遗传杂交，从而产生包括所述核酸内切酶和所述至少一个核酸序列的后代，来自所述后代的雄性昆虫卵成熟至成年。
2.一种产生不育雄性昆虫卵的基因修饰的后代的方法，包括权利要求1所述的方法，其中所述至少一个核酸序列进一步包括至少一个第二引导多核苷酸，所述第二引导多核苷酸靶向雄性特异性生育力所必需的雄性不育基因组序列，其中将所述第一昆虫和所述第二昆虫遗传杂交产生不育雄性昆虫卵的后代。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述将至少一个核酸序列整合到所述第一昆虫的基因组中包括纯合地整合到所述基因组中的所有染色体拷贝中。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述整合所述至少一个核酸序列包括在胚胎阶段期间将所述至少一个核酸序列引入所述第一昆虫中。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个第一引导多核苷酸和所述至少一个第二引导多核苷酸各自包括至少一个引导核糖核酸(gRNA)。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述雌性必要的基因组序列包括雌性特异性生存力必要的基因或雌性特异性发育和/或雌性特异性生存力必要的雌性特异性外显子。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个第一引导多核苷酸包括多于一个第一引导多核苷酸，每一个所述第一引导多核苷酸靶向雌性特异性生存力所必需的相同的雌性必要的基因组序列的不同区域。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个第一引导多核苷酸包括多于一个第一引导多核苷酸，每一个所述第一引导多核苷酸靶向雌性特异性生存力所必需的不同的雌性必要的基因组序列。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述雌性必要的基因组序列是基因或基因的剪接变体，所述基因选自性决定致死基因(Sxl)、转换基因(Tra)、双性基因(Dsx)、其同源物、其直系同源物、其旁系同源物及其组合。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个第一引导多核苷酸包括多于一个第一引导多核苷酸，每一个所述第一引导多核苷酸靶向选自Sxl、Tra、Dsx、其同源物、其直系同源物和其旁系同源物的不同基因。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多于一个第一引导多核苷酸包括两个第一引导多核苷酸，每一个所述第一引导多核苷酸靶向选自Sxl、Tra、Dsx、其同源物、其直系同源物和其旁系同源物的不同基因。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述多于一个第一引导多核苷酸包括两个第一引导多核苷酸，每一个所述第一引导多核苷酸靶向选自Sxl、Dsx、其同源物、其直系同源物和其旁系同源物的不同基因。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述雄性不育基因组序列是选自βTubulin85D(βTub)、fuzzyonions(Fzo)、鱼精蛋白A(ProtA)和精母细胞阻滞(Sa)的基因。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中：当所述第二昆虫是雄性时，将所述核酸内切酶引入所述第二昆虫中包括纯合地整合编码所述核酸内切酶的基因，和当所述第二昆虫为雌性时，将所述核酸内切酶引入所述第二昆虫中包括纯合地或杂合地整合编码所述核酸内切酶的基因或将核酸内切酶蛋白质沉积到所述第二昆虫中。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述将核酸内切酶引入第二昆虫中包括在胚胎阶段期间将所述核酸内切酶引入所述第二昆虫中。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸内切酶包括CRISPR-相关序列9(Cas9)核酸内切酶或其变体、CRISPR-相关序列13(Cas13)核酸内切酶或其变体、CRISPR-相关序列6(Cas6)核酸内切酶或其变体、来自普雷沃氏菌和弗朗西斯氏菌1的CRISPR(Cpf1)核酸内切酶或其变体或来自Microgenomates和Smithella1的CRISPR(Cms1)核酸内切酶或其变体。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸内切酶包括酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、新凶手弗朗西斯氏菌Cas9(FnCas9)或其变体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述其变体包括前间区序列邻近基序(PAM)SpCas9(xCas9)、高保真度SpCas9(SpCas9-HF1)、高保真度SaCas9或高保真度FnCas9。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸内切酶包括Cas融合核酸酶，所述Cas融合核酸酶包括与FokI核酸酶或其变体融合的Cas9蛋白质或其变体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述其变体包括催化无活性的Cas9(死亡Cas9)。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸内切酶是Cas9、Cas13、Cas6、Cpf1、CMS1蛋白质或其任何变体，其源自海沼甲烷球菌C7、白喉棒状杆菌、高效棒状杆菌YS-314、谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)、谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)、谷氨酸棒杆菌R、柯氏棒状杆菌(DSM44385)、脓肿分枝杆菌(ATCC19977)、皮疽诺卡菌IFM10152、红平红球菌PR4、贾斯汀红球菌RHA1、不透明红球菌B4(uid36573)、解纤维素热酸菌11B、氯酚节杆菌A6、Kribbellaflavida(DSM17836、uid43465)、弯曲热单孢菌(DSM43183)、齿双歧杆菌Bd1、长双歧杆菌DJO10A、还原天芥菜碱斯奈克氏菌(DSM20476)、PersephonellamarinaEXH1、脆弱拟杆菌NCTC9434、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(DSM7271)、嗜冷黄杆菌JIP0286、嗜粘蛋白艾克曼菌(ATCCBAA835)、光合玫瑰菌(DSM13941)、玫瑰弯菌属RS1、集胞藻属PCC6803、微小迷踪菌Pei191、未培养的白蚁第1类细菌菌种RsD17、产琥珀酸丝状杆菌S85、蜡状芽孢杆菌(ATCC10987)、无害利斯特菌、干酪乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌GG、唾液乳酸杆菌UCC118、无乳链球菌-5-A909、无乳链球菌NEM316、无乳链球菌2603、似马停乳链球菌GGS124、马链球菌兽瘟亚种MGCS10565、解没食子酸链球菌UCN34(uid46061)、戈尔登氏链球菌子集CH1、变形链球菌NN2025(uid46353)、变形链球菌、酿脓链球菌M1GAS、酿脓链球菌MGAS5005、酿脓链球菌MGAS2096、酿脓链球菌MGAS9429、酿脓链球菌MGAS10270、酿脓链球菌MGAS6180、酿脓链球菌MGAS315、酿脓链球菌SSI-1、酿脓链球菌MGAS10750、酿脓链球菌NZ131、嗜热链球菌CNRZ1066、嗜热链球菌LMD-9、嗜热链球菌LMG18311、肉毒梭状芽胞杆菌A3LochMaree、肉毒梭状芽胞杆菌BEklund17B、肉毒梭状芽胞杆菌Ba4657、肉毒梭状芽胞杆菌FLangeland、解纤维素梭菌H10、大芬戈尔德菌(ATCC29328)、直肠真杆菌(ATCC33656)、鸡败血支原体、可移动支原体163K、穿通支原体、滑液囊支原体53、念珠状链杆菌(DSM12112)、慢生根瘤菌BTAi1、汉氏硝化细菌X14、红假单胞菌属双B18、红假单胞菌属双B5、食清洁剂细小棒菌DS-1、芝江沟鞭玫瑰杆菌DFL12、重氮营养葡糖酸醋杆菌Pal5FAPERJ、重氮营养葡糖酸醋杆菌Pal5JGI、固氮螺菌B510(uid46085)、深红红螺菌(ATCC11170)、对氯苯胺TPSY(uid29975)、蚯蚓肾寄生菌EF01-2、脑膜炎奈瑟菌053442、脑膜炎奈瑟菌α14、脑膜炎奈瑟菌Z2491、需盐脱硫弧菌DSM2638、空肠弯曲杆菌德莱亚种26997、空肠弯曲菌81116、空肠弯曲菌、红嘴鸥弯曲杆菌RM2100、肝螺旋杆菌、产琥珀酸沃廉菌、奥湖甲苯单胞菌DSM9187、大西洋假交替单胞菌T6c、Shewanellapealeana(ATCC700345)、巴黎嗜肺军团菌、琥珀酸放线杆菌130Z、多杀性巴氏杆菌、FrancisellatularensisnovicidaU112、Francisellatularensisholarctica、土拉热弗朗西斯菌FSC198、Francisellatularensistularensis、土拉热弗朗西斯菌WY96-3418或齿垢密螺旋体(ATCC35405)。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一昆虫和所述第二昆虫是相同的昆虫或能够交配的两种不同的昆虫，并且在选自双翅目、鳞翅目或鞘翅目的目中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述昆虫是来自覆蚊亚属、伊蚊、按蚊或库蚊属的蚊虫。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述蚊虫选自埃及伊蚊、白纹伊蚊、三列骚扰蚊亚属(三列伊蚊)、斯氏按蚊、白魔按蚊、冈比亚按蚊、四斑按蚊、泛生按蚊、库蚊种和黑尾赛蚊。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述昆虫选自：实蝇科果蝇，其选自地中海果蝇(Medfly)(地中海实蝇(Ceratitiscapitata))、Mexfly(墨西哥按实蝇(Anastrephaludens))、东方果蝇(Orientalfruitfly)(橘小实蝇(Bactrocerador...
【专利技术属性】
技术研发人员：N·P·康杜尔，O·S·阿巴里，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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