一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，通过全基因合成突变体GOD‑8基因序列，并通过重叠延伸PCR扩增GOD‑M523L‑M524L、GOD‑M524L‑M528L突变体基因序列，构建葡萄糖氧化酶及突变体表达载体；通过基因突变常规葡萄糖氧化酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能，过程中先设计出突变体，之后通过毕赤酵母表达得到相应的纯酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能；解决了葡萄糖氧化酶抗氧化性差，导致其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中生产率低的技术问题；本发明专利技术还公开了一种测定装置，通过设置多个检测头和检测仪，能够同时对含量进行测定，防止出现误差，而且同时进行，缩短测定时间，在储液盒中设置缓流机构能够防止流速等因素存在导致测定不准确。

【技术实现步骤摘要】
一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法
本专利技术属于分子酶
，具体为一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法。
技术介绍
葡糖氧化酶(GlucoseOxidase，GOD)是食品工业中一种重要的工业用酶，广泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脱氧、面粉改良、防止食品褐变等方面，在食品快速检测及生物传感器上也有广泛应用。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。中国专利技术专利CN105209611B公开了一种具有改进性质的新型微生物葡糖氧化酶变体，更具体地涉及具有葡糖氧化酶活性作为其主要酶活性的多肽；涉及编码所述葡糖氧化酶的核酸分子；含有该核酸的载体和宿主细胞和用于生产该葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品饲料加工的方法、用于测量临床样品和生物反应器中的游离葡萄糖的方法和开发微型生物燃料电池的方法。
技术实现思路
为了克服上述的技术问题，本专利技术提供一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法。本专利技术所要解决的技术问题：(1)葡萄糖氧化酶抗氧化性差，导致其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中生产率低；(2)现有的用于蛋白测定的测定装置无法同时进行多组测定，测定效率低，而且容易受到外界环境的影响，影响测定的准确性能。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：步骤S1、通过全基因合成突变体GOD-8基因序列，并通过重叠延伸PCR扩增GOD-M523L-M524L、GOD-M524L-M528L突变体基因序列，构建葡萄糖氧化酶及突变体表达载体；步骤S2、合成突变体基因后，通过分子克隆到pPIC9K载体上，重组表达载体转入毕赤酵母GS115菌株中，28℃-30℃培养3-4天，将MD平板上长出来的重组子，同时转接到MD和MM平板上，28℃温箱培养48h，之后制得显色液并将显色液检测、筛选，收集上清液，制得纯酶样品；步骤S3、对制得的纯酶样品通过测定装置进行蛋白质含量测定，具体步骤如下所示：配制浓度为1.2U/mL葡萄糖氧化酶标准溶液，之后配置待检测液，将待检测液加入传液箱中，待检测液通过导液管和进液口进入储液盒中，通过缓流管，待检测液缓流进储液盒中，密闭顶盖，调节限位板对测定仪限位固定，测定仪底端安装测定头，调节第一固定板和第二固定板，第一固定板和第二固定板带动驱动泵机以及测定头上下移动，打开驱动泵机，测定头对待检测液进行抽取，测定仪测定，之后通过分析表盘进行读取。进一步地，步骤S3中待检测液由如下方法配置：将邻联茴香胺、质量分数10％葡萄糖溶液和质量分数10％过氧化氢酶溶液混合，反在37℃保温5min后，加入1.2U/mL葡萄糖氧化酶，在此温度下反应3min后，加入体积分数98％浓硫酸，振荡摇匀直至反应终止，制得待检测液，控制邻联茴香胺、10％葡萄糖溶液、10％过氧化氢酶溶液、1.2U/mL葡萄糖氧化酶和浓硫酸的重量比为10∶1∶0.1∶0.1∶5。进一步地，步骤S3中测定装置包括外壳机构、测定机构、进液机构和储液机构；外壳机构包括固定箱、分析表盘、连接杆、滑块、水平滑板、滑轨和固定架，固定架安装在固定箱上表面，分析表盘安装在固定架侧表面中心位置，连接杆一端与分析表盘固定，连接杆另一端与固定架侧表面固定，滑块、水平滑板和滑轨均安装在固定架内部，三根滑轨安装在固定箱上表面，滑轨与固定箱为可拆卸固定，水平滑板安装在滑轨上表面，水平滑板下表面安装滑块，滑块与滑轨配合；测定机构包括支撑板、竖直支撑杆、驱动泵机、第一固定板、连接管、第二固定板、测定仪、限位板和测定头，四个竖直支撑杆安装在固定箱上表面，竖直支撑杆与固定箱固定，支撑板安装在竖直支撑杆顶端，竖直支撑杆贯穿第一固定板和第二固定板，驱动泵机、连接管、测定仪和测定头从上往下依次安装，四个驱动泵机安装在第一固定板上表面，每个驱动泵机底端与连接管固定，连接管顶端与驱动泵机连接，连接管底端与测定仪连接，测定仪与分析表盘连接，测定仪贯穿第二固定板和限位板，限位板安装在第二固定板上表面，测定仪底端安装测定头；进液机构包括第一支撑架、第二支撑架、L型固定架、传液箱、竖直滑板、伸缩杆和导液管，第一支撑架、第二支撑架均安装在固定箱上表面，L型固定架和传液箱安装在第一支撑架上表面，传液箱通过L型固定架固定在第一支撑架上方，L型固定架侧表面上方固定传液箱，L型固定架下表面固定在第一支撑架上表面，L型固定架与传液箱和第一支撑架均通过螺栓固定，竖直滑板和伸缩杆安装在第二支撑架上方，伸缩杆顶端贯穿竖直滑板，伸缩杆底端固定在第二支撑架上表面，导液管贯穿第一支撑架上表面与传液箱连通；储液机构包括储液盒、顶盖、缓流管、连通管、进液口、测定口和隔板，储液盒安装在水平滑板上表面，缓流管、连通管和隔板安装在储液盒内部，进液口通过导管与导液管连通，缓流管一端与进液口连通，缓流管另一端连接连通管，顶盖上设置测定口，测定口与连通管连通，连通管通过隔板卡扣在储液盒内部。进一步地，测定机构、进液机构和储液机构均安装在外壳机构内部，两个进液机构安装在测定机构两侧表面，两个进液机构安装在外壳机构内部侧表面，储液机构安装在测定机构下方，两个进液机构与储液机构两端连通。进一步地，支撑板、竖直支撑杆、驱动泵机、第一固定板、连接管、第二固定板、测定仪、限位板和测定头均安装在固定架内部。进一步地，第一支撑架、第二支撑架、L型固定架、传液箱、竖直滑板、伸缩杆和导液管均安装在固定架内部。进一步地，该测定装置的测定过程如下所示：第一步、将支撑板、竖直支撑杆、驱动泵机、第一固定板、连接管、第二固定板、测定仪、限位板和测定头均安装在固定架内部，竖直支撑杆贯穿第一固定板和第二固定板；第二步、将四个驱动泵机安装在第一固定板上表面，每个驱动泵机底端与连接管固定，连接管顶端与驱动泵机连接，连接管底端与测定仪连接，测定仪与分析表盘连接；第三步、将待检测液加入传液箱中，通过导液管和进液口进入储液盒中，通过缓流管，待检测液缓流进储液盒中，密闭顶盖，测定仪底端安装测定头，调节第一固定板和第二固定板，第一固定板和第二固定板带动驱动泵机以及测定头上下移动，打开驱动泵机，测定头对待检测液进行抽取，测定仪进行测定，之后通过分析表盘进行读取。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法通过基因突变常规葡萄糖氧化酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能，过程中先设计出突变体，之后通过毕赤酵母表达得到相应的纯酶，进而提高葡萄糖氧化酶的氧化性能；解决了葡萄糖氧化酶抗氧化性差，导致其在葡萄糖氧化为葡萄糖酸的生产中生产率低的技术问题。(2)本专利技术还制备出一种用于检测蛋白含量的测定装置，在装置在使用过程中将待检测液加入传液箱中，通过导液管和进液口进入储液盒中，通过缓流管，待检测液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1、通过全基因合成突变体GOD-8基因序列，并通过重叠延伸PCR扩增GOD-M523L-M524L、GOD-M524L-M528L突变体基因序列，构建葡萄糖氧化酶及突变体表达载体；/n步骤S2、合成突变体基因后，通过分子克隆到pPIC9K载体上，重组表达载体转入毕赤酵母GS115菌株中，28℃-30℃培养3-4天，将MD平板上长出来的重组子，同时转接到MD和MM平板上，28℃温箱培养48h，之后制得显色液并将显色液检测、筛选，收集上清液，制得纯酶样品；/n步骤S3、对制得的纯酶样品通过测定装置进行蛋白质含量测定，具体步骤如下所示：/n配制浓度为1.2U/mL葡萄糖氧化酶标准溶液，之后配置待检测液，将待检测液加入传液箱(34)中，待检测液通过导液管(37)和进液口(45)进入储液盒(41)中，通过缓流管(43)，待检测液缓流进储液盒(41)中，密闭顶盖(42)，调节限位板(28)对测定仪(27)限位固定，测定仪(27)底端安装测定头(29)，调节第一固定板(24)和第二固定板(26)，第一固定板(24)和第二固定板(26)带动驱动泵机(23)以及测定头(29)上下移动，打开驱动泵机(23)，测定头(29)对待检测液进行抽取，测定仪(27)测定，之后通过分析表盘(12)进行读取。/n...

【技术特征摘要】
1.一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、通过全基因合成突变体GOD-8基因序列，并通过重叠延伸PCR扩增GOD-M523L-M524L、GOD-M524L-M528L突变体基因序列，构建葡萄糖氧化酶及突变体表达载体；
步骤S2、合成突变体基因后，通过分子克隆到pPIC9K载体上，重组表达载体转入毕赤酵母GS115菌株中，28℃-30℃培养3-4天，将MD平板上长出来的重组子，同时转接到MD和MM平板上，28℃温箱培养48h，之后制得显色液并将显色液检测、筛选，收集上清液，制得纯酶样品；
步骤S3、对制得的纯酶样品通过测定装置进行蛋白质含量测定，具体步骤如下所示：
配制浓度为1.2U/mL葡萄糖氧化酶标准溶液，之后配置待检测液，将待检测液加入传液箱(34)中，待检测液通过导液管(37)和进液口(45)进入储液盒(41)中，通过缓流管(43)，待检测液缓流进储液盒(41)中，密闭顶盖(42)，调节限位板(28)对测定仪(27)限位固定，测定仪(27)底端安装测定头(29)，调节第一固定板(24)和第二固定板(26)，第一固定板(24)和第二固定板(26)带动驱动泵机(23)以及测定头(29)上下移动，打开驱动泵机(23)，测定头(29)对待检测液进行抽取，测定仪(27)测定，之后通过分析表盘(12)进行读取。


2.根据权利要求1所述的一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，步骤S3中待检测液由如下方法配置：将邻联茴香胺、10％葡萄糖溶液和10％过氧化氢酶溶液混合，反在37℃保温5min后，加入1.2U/mL葡萄糖氧化酶，在此温度下反应3min后，加入98％浓硫酸，振荡摇匀直至反应终止，制得待检测液，控制邻联茴香胺、10％葡萄糖溶液、10％过氧化氢酶溶液、1.2U/mL葡萄糖氧化酶和浓硫酸的重量比为10∶1∶0.1∶0.1∶5。


3.根据权利要求1所述的一种通过基因突变提高抗氧化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，步骤S3中测定装置包括外壳机构(1)、测定机构(2)、进液机构(3)和储液机构(4)；
外壳机构(1)包括固定箱(11)、分析表盘(12)、连接杆(13)、滑块(14)、水平滑板(15)、滑轨(16)和固定架(17)，固定架(17)安装在固定箱(11)上表面，分析表盘(12)安装在固定架(17)侧表面中心位置，连接杆(13)一端与分析表盘(12)固定，连接杆(13)另一端与固定架(17)侧表面固定，滑块(14)、水平滑板(15)和滑轨(16)均安装在固定架(17)内部，三根滑轨(16)安装在固定箱(11)上表面，滑轨(16)与固定箱(11)为可拆卸固定，水平滑板(15)安装在滑轨(16)上表面，水平滑板(15)下表面安装滑块(14)，滑块(14)与滑轨(16)配合；
测定机构(2)包括支撑板(21)、竖直支撑杆(22)、驱动泵机(23)、第一固定板(24)、连接管(25)、第二固定板(26)、测定仪(27)、限位板(28)和测定头(29)，四个竖直支撑杆(22)安装在固定箱(11)上表面，竖直支撑杆(22)与固定箱(11)固定，支撑板(21)安装在竖直支撑杆(22)顶端，竖直支撑杆(22)贯穿第一固定板(24)和第二固定板(26)，驱动泵机(23)、连接管(25)、测定仪(27)和测定头(29)从上往下依次安装，四个驱动泵机(23)安装在第一固定板(24)上表面，每个驱动泵机(23)底端与连接管(25)固定，连接管(25)顶端与驱动泵机(23)连接，连接管(25)底端与测定仪(27)连接，测定仪(27)与分析表盘(12)连接，测定仪(27)贯穿第二固定板(26)和限位板(28)，限位板(28)安装在第二固定板(26)上表面，测定仪(27)底端安装测定...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，喻明军，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34