一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法技术

本发明专利技术提供一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法，首次采用具有抑制革兰氏阴性菌的中药材提取物进行黄龙病菌抑菌试验，结果显示五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物的抑菌效果明显，同时采用高效液相技术对化合物进行分离，再利用

【技术实现步骤摘要】
一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法
本专利技术涉及柑橘病虫防治领域，具体涉及一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法。
技术介绍
柑橘(CitrusL.)属芸香科柑橘亚科是热带、亚热带常绿果树，可以用于作为经济栽培的主要有三个属：积属、柑橘属和金柑属，其中又以柑橘属为主要栽培品种。中国是世界三大柑橘主要生产国家之一，已有四千多年的悠久栽培历史，种植资源也非常丰富。我国柑橘的经济栽培区主要分布在北纬20-30度之间，海拔700-1000米以下。全国栽培柑橘主要分布在包括台湾省在内有19个省，其中主产柑橘的有浙江、福建、湖南、四川、广西、湖北、广东、江西、重庆和台湾等10个省(市、区)。柑橘果实中营养丰富，色香味俱全，果实即可用于新鲜食用，又可用于果汁的加工，还可以从果皮和果肉中提取香精油等工业深层次加工。柑橘种子中富含有维生素E，可以用于榨取植物油和提取植物蛋白。我国柑橘的产量居各种水果之首，受到广大消费者的青睐。在我国柑橘产业已经成为农业产业结构调整、农民增收的主导和支柱项目。我国的柑橘品种主要可以分为柑类、橘类、橙类、柠檬类和柏类五个方面。其中又以宽皮柑橘为主要生产和栽培品种。我国宽皮柑橘占柑橘总产量的71％，橙类占16％柚子类和其它占13％。而世界柑橘以橙类为主(锦橙、脐橙)，约占63％，宽皮柑橘(温州蜜柑、碰柑)占17％，葡萄柏、柠檬等占20％。温州蜜柑是我国柑橘栽培的主要种类，目前栽培较多的为早熟的宫川、兴津等早熟品种，成熟期一般在10月上中旬。但在10月以前成熟的品种不多，表现较好的更少。碰柑是我国宽皮橘的优势类型和主要出口类型。目前，栽培的品种的成熟期以中熟为主，早熟和晚熟品种栽培较少，一般可在10月下旬至11月中下旬采收。锦橙又名鹅蛋柑26号，原产中国重庆江津，系40年代从地方实生甜橙中选出的优良变异，是中国甜橙中发展最快的品种，一般在11月下旬成熟。黄龙病是柑橘的一种致命性病菌灾害，染病后的植株分支变多，叶片变小且呈斑驳性黄化，果实着色不均匀且呈畸形，较正常果实小，严重影响柑橘产量和品质。并且一片柑橘园一旦发现病情，很快便会蔓延整块桔园。目前尚无有效的防治方法，植株染病后，只能挖除销毁，对柑橘产业具有毁灭性的后果。其病原菌是韧皮部限制的革兰氏阴性菌，分为亚洲种(CarndidatusLiberibacterasiaticus,Ca.Las)、美洲种(CarndidatusLiberibacteramericanus,Ca.Lam)、非洲种(CandidatesLiberibacterafricanus,Ca.Laf)，其中亚洲种危害最严重。柑橘木虱(Diaphorinacitri)(昆虫纲，同翅目，木虱科)主要危害柑橘等芸香科植物，也是黄龙病在自然界的主要传播媒介。现有技术存在的问题：现有技术中还未见有效的防治黄龙病的方法，特别是未见利用中草药的有效成分及其修饰化合物防治黄龙病的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的关键技术问题在于提供一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法，通过从抑菌中药中提取有效部位和有效单体制成黄龙病菌的抑制剂。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：1、一种黄龙病病原菌分离和培养方法，包括：(1)样品的采集与处理；(2)黄龙病菌培养基配置；(3)黄龙病菌种培养与培养体系优化；(4)基于16SrDNA的菌种鉴定。2、一种黄龙病菌抑菌剂的提取方法，包括如下步骤：(1)药材选择与组合物提取；(2)提取部位抑菌效果验证；(3)组合物黄龙病防治效果验证。3、一种黄龙病菌抑菌化合物的提取方法，包括如下步骤：(1)高效液相色谱分离活性成分；(2)抑菌效果验证；(3)抑制剂化学结构解释；(4)化合物黄龙病防治效果验证。4、五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物在抑制黄龙病菌中的应用。5、没食子酸和水杨酸在抑制黄龙病菌中的应用。附图说明图1为本专利技术抑菌圈测量图；图中，d代表抑菌圈直径。具体实施方法本专利技术专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本专利技术专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本专利技术专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本专利技术专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本专利技术专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。实施例1本实施例提供了黄龙病病原菌分离和培养方法，包括：(1)样品的采集与处理用于黄龙病病原菌培养的实验材料均取自有典型症状的感病柑橘植株。剪取样品材料的根、茎、叶，果实，冲洗除去表面杂物和灰尘，使用滤纸吸干样品材料表面的水分。其中根、茎可直接作为实验材料剪取需要的用量，叶片剪取中脉部分作为实验材料，果实取橘络作为实验材料。表面消毒工作需在超净工作台完成，操作时用镊子夹住材料基部将其浸没在95％乙醇溶液中，取出后甩去材料表面多余乙醇，酒精灯上点燃，按时间精准灼烧灭菌，灭菌后进行接种操作，样品材料放置于-20℃冰箱保存。(2)黄龙病菌培养基配置取新鲜无农药残留的脐橙成熟果实榨汁，用纱布过滤去除果肉等纤维组织，过滤灭菌，4℃保存。磷酸钠缓冲液：称取Na2HPO4·H2O44.5g，Na2HPO4·2H2O1.27g用去离子水定容到1L，121℃，20min。脐橙叶片汁液：称取5g2年生新鲜叶片，去离子水洗净后晾干，液氮研磨，加磷酸钠缓冲液20mL常温解冻，121℃20min灭菌，4℃保存备用。LB果汁培养基(LB培养基+脐橙果汁液200mL/L)；NB果汁培养基(NB培养基+脐橙果汁液200mL/L)；叶汁培养基(脐橙叶片汁液200mL/L+去离子水)；果汁培养基(脐橙果汁液200mL/L+去离子水)。叶汁琼脂培养基(脐橙叶片汁液200mL/L、琼脂20g/L)，NB果汁琼脂培养基(NB培养基、脐橙果汁液200mL/L，琼脂20g/L)。(3)黄龙病菌种培养与培养体系优化超净工作台随机选取实验样品的叶片、茎、根部和果实无菌水冲洗5-6次，收集最后一次冲洗的冲洗液。吸取100mL冲洗液，在叶汁琼脂培养基和NB果汁琼脂培养基上涂布均匀；置于28℃细菌恒温培养箱中培养2-3天。菌落长出后，挑选不同形状菌落分别加入到LB果汁培养基、NB果汁培养基、叶汁培养基、果汁培养基中培养。测定菌液浊度和菌斑大小确定每个菌种的最佳培养基。结果显示：亚洲种、美洲种的最佳固体培养基为叶汁琼脂培养基、非洲种的最佳固体培养基为NB果汁琼脂培养基；亚洲种的最佳液体培养基为叶汁培养基，美洲种和非洲种的最佳液体培养基为LB果汁培养基。(4)菌种鉴定采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)按试剂盒说明书操作提取菌液DNA，采用细菌通用16SrDNA扩增引物进行扩增。使用TaqMas本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄龙病病原菌分离和培养方法，其特征在于，包括：(1)样品的采集与处理；(2)黄龙病菌培养基配置；(3)黄龙病菌种培养与培养体系优化；(4)基于16S rDNA的菌种鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种黄龙病病原菌分离和培养方法，其特征在于，包括：(1)样品的采集与处理；(2)黄龙病菌培养基配置；(3)黄龙病菌种培养与培养体系优化；(4)基于16SrDNA的菌种鉴定。


2.一种黄龙病菌抑菌剂的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)药材选择与组合物提取；(2)提取部位抑菌效果验证；(3)组合物黄龙病防治效果验证。


3.一种黄龙病菌抑菌化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)高效液相色谱分离活性成分；(2)抑菌效果验证；(3)抑制剂化学结构解释；(4)化合物黄龙病防治效果验证。


4.五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物在...

【专利技术属性】
技术研发人员：严建彬，郑新添，林标声，钟志龙，
申请(专利权)人：易之泰生物科技龙岩有限公司，龙岩学院，
类型：发明
国别省市：福建;35