通过靶向抑制DNA扩增来选择性富集混合DNA样品中的DNA群体制造技术

本公开内容提供了用于在包含多个DNA群体的混合样品中选择性富集一个DNA群体的方法和产物。在一些实施方案中，所述混合样品包含一个或更多个微生物DNA和哺乳动物宿主DNA群体，特别是包含在来自感染个体的临床样品中与哺乳动物宿主DNA混合的病原微生物DNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过靶向抑制DNA扩增来选择性富集混合DNA样品中的DNA群体技术背景哺乳动物组织中的病原微生物感染是一个主要的保健问题。血液的细菌感染(称为菌血症(bacteremia))通常可用抗生素进行治疗，但有时导致脓毒症，脓毒症是危及生命的疾病，其中如果不及时治疗整个身体会变得发炎，导致多器官衰竭并最终死亡。随着抗菌抗性的提高，细菌感染的治疗变得更加具有挑战性。仅在美国，每年约有2,000,000名患者患有具抗菌抗性生物体的细菌感染并且这些患者中的约100,000名因感染而死亡。目前在医院中诊断的感染中接近一半对至少一种常见的抗菌药物具有抗性，并且在药物抗性感染的情况下，死亡风险可翻倍。迅速且正确鉴定感染中所涉及的病原体及其抗菌易感性模式对避免永久性伤害或死亡可以是至关重要的。迅速且全面鉴定病原体及其抗菌易感性模式的一个主要挑战是病原体通常是生物样品中的非常小的部分。例如，在临床相关的血液样品中，每毫升血液中的病原性细胞可少于10个。同时，可存在数十亿个人细胞，每个人细胞容纳约1,000倍以上的基因组物质，这对于诊断，特别是基于核酸的诊断提出了严峻的挑战。用于克服该挑战的传统方法是通过在允许生长的环境(例如对于细菌或真菌而言的营养丰富的肉汤或者对于病毒而言的允许的细胞系)中培养试样来产生更大的病原体群体。培养病原体可使病原体：人DNA的比提高至少一百万倍，但这很耗时并且通常可能无法产生成功的结果。例如，从血液中进行细菌培养可花费至少36小时来产生纯菌落，并且在几乎一半的严重脓毒症病例中无法培养病原微生物(Martinetal.(2003)，NewEng.J.Med.，348：1546-1554)。另外，尽管在存在抗生素的情况下培养细菌仍然是全面抗生素易感性测试(antibioticsusceptibilitytesting，AST)的黄金标准，但该过程需要至少数天，而在难以培养的病原体(例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))的情况下则需要三周或更长时间。这种延迟对于患者而言可能是致命的，他们在严重血流感染中的死亡风险每小时可提高8％。医师使用采用功能强大的旨在对感染“进行地毯式轰炸(carpetbomb)”的广谱抗生素的经验治疗进行治疗而不是等待。这种方法是昂贵的，使患者暴露于显著的药物毒性并促使抗生素抗性的扩散。最重要的是，由于多个药物抗性病原微生物的风险，经验治疗正在变得越来越低效。为了缩短诊断时间，经常采用基于核酸的诊断。目前的测定主要依赖于以聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)形式的靶向核酸扩增来选择性地将病原体基因组的短的(＜1千碱基)、预选的区域扩增至在背景人DNA水平之上的可检测水平。基于PCR的诊断可以是快速的，但是其对靶探针的依赖将其限制于有限数量的靶标，这阻止了其全面鉴定已知病原体物种(其中有数千种)和已知抗菌抗性基因(其中存在至少1,600种基于PCR的诊断在确定复杂的、基于多态性的抗性方面也不总是精确的)。另外，靶向扩增对抗菌抗性(antimicrobialresistance，AMR)基因的遗传背景是缺乏了解的(blind)，该遗传背景对于以下情况，例如多种微生物细菌感染、污染物(例如携带mecA的表皮葡萄球菌(Staphylococcalepidermidis))的存在以及当基因位置重要时是至关重要的。为了允许病原体的全面鉴定以及不仅鉴定公知的且良好表征的抗性基因，而且鉴定更复杂的抗性机制，全基因组测序(whole-genomesequencing，WGS)在过去的数年中已作为用于病原体鉴定和抗菌易感性二者的有希望的新诊断方法出现。在全基因组扩增(wholegenomeamplification，WGA)之后对病原微生物的全基因组进行测序可解决与传统培养相关的一些问题。例如，在细胞培养中使用体外酶活性来扩增DNA序列而不是体内复制，可将产生可用量的微生物遗传物质所需的时间从数天显著缩短至数小时。另外，避免细胞培养还使得能够从微生物(包括即使用现代培养方法也不可培养的病原微生物物种)中扩增DNA(例如Kvistetal.(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.74(4)：926-935；Huangetal.(2015)，Ann.Rev.GenomicsHum.Genet.，16：79-102)。然而，当宿主DNA或污染性DNA可比目的DNA更丰富多达8至9个对数时，在本领域中仍需要有效地成功产生全基因组序列的改进方法。以无偏的方法在包含微生物和哺乳动物核酸的混合物的生物样品中选择性或优先扩增和富集核酸(包括病原微生物DNA)的子集可使得能够使用WGA进行高灵敏度诊断。
技术实现思路
本专利技术部分依赖于用于在DNA扩增样品中富集微生物核酸的改进方法的开发，所述DNA扩增样品通过扩增包含核酸的至少第一群体和第二群体的混合样品而产生。另外，本专利技术提供了改进的阻断寡核苷酸，其可降低不期望序列的扩增，并因此当进行非靶向的扩增反应(例如在等温扩增期间使用随机六聚体)时富集所期望核酸的样品。在一方面中，本专利技术提供了用于在DNA扩增样品中富集核酸(例如微生物或非宿主核酸)群体的改进方法，所述DNA扩增样品通过扩增包含核酸的至少第一群体和第二群体的混合样品而产生，所述改进包括：在扩增步骤期间在核酸的至少第一群体和第二群体的混合样品中抑制核酸的第一群体中某些序列的扩增(例如哺乳动物或宿主序列)。根据本专利技术，通过向混合样品添加至少一种阻断寡核苷酸来抑制第一群体(例如哺乳动物或宿主DNA)的某些序列的扩增，所述阻断寡核苷酸与混合样品中核酸的第一群体中的至少一种DNA序列特异性结合并抑制该结合DNA序列的扩增。在一些实施方案中，采用了阻断寡核苷酸的集合，其抑制核酸的第一群体中存在的与所述阻断寡核苷酸的集合基本上互补的DNA序列集合的扩增。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包括：包含与这样的序列互补的6至23个核苷酸的寡核苷酸，所述序列在核酸的第一群体(例如哺乳动物、线粒体或宿主基因组)中比在核酸的第二群体(例如微生物、细菌或非宿主基因组)中更频繁地出现。在一些实施方案中，该序列在核酸的第一群体中比在核酸的第二群体中更频繁2至50倍地出现。在一些实施方案中，微生物基因组是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)或与菌血症相关的任何其他细菌物种。在一些实施方案中，至少一种阻断寡核苷酸选自SEQIDNO：1至16。在一些实施方案中，至少一种阻断寡核苷酸与选自SEQIDNO：17至32的序列结合。在一些实施方案中，至少两种阻断寡核苷酸的集合与分布在DNA的整个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过扩增包含第一群体和第二群体的DNA混合样品来富集DNA群体的改进方法，所述改进包括：/n(a)使所述DNA混合样品与多种阻断寡核苷酸接触，所述阻断寡核苷酸特异性地与DNA的所述第一群体中的多个寡核苷酸序列结合；以及/n(b)对所述DNA混合样品进行扩增以产生经扩增DNA混合样品；/n其中所述阻断寡核苷酸抑制DNA的所述第一群体的扩增，并且因此在所述经扩增混合样品中相对于DNA的所述第一群体富集DNA的所述第二群体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171018 US 62/573,7201.通过扩增包含第一群体和第二群体的DNA混合样品来富集DNA群体的改进方法，所述改进包括：
(a)使所述DNA混合样品与多种阻断寡核苷酸接触，所述阻断寡核苷酸特异性地与DNA的所述第一群体中的多个寡核苷酸序列结合；以及
(b)对所述DNA混合样品进行扩增以产生经扩增DNA混合样品；
其中所述阻断寡核苷酸抑制DNA的所述第一群体的扩增，并且因此在所述经扩增混合样品中相对于DNA的所述第一群体富集DNA的所述第二群体。


2.权利要求1所述的方法，其中：
(a)所述多种阻断寡核苷酸中的每一种包含6至50个核苷酸的序列，所述序列在DNA的所述第一群体中具有相对于DNA的所述第二群体的至少50的相对发生率；以及
(b)所述多种阻断寡核苷酸中的每一种包含至少6至25个核苷酸的3’序列，所述序列在DNA的所述第一群体中具有相对于DNA的所述第二群体的至少2的相对发生率。


3.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种包含至少6、7、8、9或10个核苷酸的序列。


4.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种包含少于50、45、40、35、30或25个核苷酸的序列。


5.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种的3’序列包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个寡核苷酸。


6.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种的3’序列包含少于25、20、15、14、13、12、11或10个寡核苷酸。


7.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种在DNA的所述第一群体中具有相对于DNA的所述第二群体的至少75、100、150、200或250的相对发生率。


8.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种的3’序列在DNA的所述第一群体中具有相对于DNA的所述第二群体的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10的相对发生率。


9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸包含至少10、20、30、40、50、75或100种不同的阻断寡核苷酸。


10.权利要求9所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸包含至少103、104、105、106、107或108种不同的阻断寡核苷酸。


11.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中：
与阻断寡核苷酸的第一群体互补的基因组序列之间的最大距离为2G/N、3G/N、4G/N或5G/N，其中G是与所述第一群体对应的基因组DNA的大小且N是在所述多种阻断寡核苷酸中不同阻断寡核苷酸的数目。


12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种还包含使所述阻断寡核苷酸与DNA的所述第一群体交联的链间交联剂。


13.权利要求12所述的方法，其中：
所述交联剂是光活化的。


14.权利要求12所述的方法，其中：
所述交联剂是补骨脂素。


15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种在3’末端包含间隔区，所述间隔区通过模板依赖性DNA合成阻止DNA聚合酶延伸所述寡核苷酸。


16.权利要求15所述的方法，其中：
每个间隔区包含与对应的阻断寡核苷酸的3’OH结合的脂肪族分子。


17.权利要求15所述的方法，其中：
所述多种阻断寡核苷酸中的每一种是翼型阻断剂。


18.权利要求17所述的方法，其中：
所述翼型阻断剂包含40至60个核苷酸的互补寡核苷酸序列，其与DNA的所述第一群体中的序列互补。


19.权利要求18所述的方法，其中：
所述翼型阻断剂在所述互补核苷酸序列的每个末端处包含10至100个核苷酸的翼型寡核苷酸序列，其中所述翼型寡核苷酸序列与DNA的所述第一群体中的侧翼序列不互补。


20.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述扩增使用链置换聚合酶进行。


21.权利要求20所述的方法，其中所述扩增使用phi29聚合酶进行。


22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中：
所述混合样品获自或来源于血液、痰、尿、黏液、唾液、组织脓肿、伤口引流、粪便、淋巴液、灌洗液、脑脊液或者人和/或其他真核来源的任何流体抽吸物或组织提取物。


23.权利要求22所述的方法，其中：
所述混合样品获...

【专利技术属性】
技术研发人员：奇亚豪·徐，梅利斯·N·阿纳赫塔尔，杜格尔·麦克劳林，米丽娅姆·H·亨特利，杰斯里·D·布鲁斯特，
申请(专利权)人：零日诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US