一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的免疫荧光试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞PD‑L1表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得晚期胃癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫荧光技术检测CTC上PD‑L1表达情况。本发明专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发胃癌患者PD‑L1表达情况。本发明专利技术提供的方法，循环肿瘤细胞分离好，能够避免血细胞的干扰，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。标志物PD‑L1使用表现出良好的特异性及灵敏度，提升了其在胃癌中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的免疫荧光试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的免疫荧光的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
胃癌（Gastriccancer,GC）是一种高度致命的恶性肿瘤，发病率居世界第四位（每年新增病例95万例），在2012年肿瘤相关死亡患者中排第三位。尽管近年来胃癌诊断和治疗方法有所改善，但胃癌患者5年生存率还不到30％，大约有50％胃癌患者治愈性切除后遭受肿瘤复发或转移。肿瘤复发和转移是胃癌患者死亡的主要原因。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。PD-1/PD-L1为免疫靶点的免疫疗法为胃癌治疗带来了新的曙光。研本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；/n一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；/n二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:50...

【技术特征摘要】
1.一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；
一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗PD-L1分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；
二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的稀释液组成为：1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%酪氨酸+PBS缓冲液150mmol/L，其中所述百分比为体积比。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒非诊断目的检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发胃癌患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（...

【专利技术属性】
技术研发人员：李胜，李浩，崔凯，夏梅，高德海，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37