本发明专利技术公开一种水溶性阳离子卟啉在制备PDT纳米光敏剂中的应用，本发明专利技术利用水溶性阳离子卟啉化合物——四碘化5,10,15,20‑四[1‑甲基‑1‑哌啶基乙氧基苯基]卟啉(TMPipEOPP)4
【技术实现步骤摘要】
一种水溶性阳离子卟啉在制备PDT纳米光敏剂中的应用
本专利技术属于光动力治疗(PDT)、化学分析和生物化学领域，特别涉及一种水溶性阳离子卟啉在制备PDT纳米光敏剂中的应用。
技术介绍
癌症是一系列相关恶性肿瘤的总称几乎可以发生于人体的任何部位，可能与遗传因素、长期接触致癌物质有关，常表现体重明显下降、疼痛、乏力等。癌症的具体病因尚未明确，但截至目前，已经有很多治疗癌症的方法。常见的有：手术治疗，化学疗法，放射疗法，光动力学治疗和光热力学治疗。其中，光动力学治疗(PDT)是对有病变的患者进行全身或者局部给药的无毒药物或染料治疗，当过了一段潜伏期以后，在氧气存在的情况下，用近红外波长的红色可见光照射特定的病灶，导致某些毒性物质的产生，从而导致细胞死亡和组织的破坏。由此可知，实现PDT的三个主要成分为：合适的光敏剂(PSs)，光和氧气，缺一不可。由于PDT的特异性和选择性，其作为癌症疗法的用途特别有吸引力，因为可以直接在病灶上产生一种活性氧(单线态氧)从而导致细胞破坏。又因具有创伤小、毒性小、能重复作用、不干扰传统治疗等优点已成为广泛研究的对象。水溶性良好为其在生物领域的应用提供了保障。但目前临床应用的光敏剂还存在着细胞摄取量低、暗毒性较强、靶向性差、吸收光波长短(导致低组织穿透能力和减少潜在治疗深部肿瘤)等缺陷。只有克服了上述缺点，水溶性阳离子卟啉类光敏剂才能真正的进一步广泛应用于癌症的治疗中。DNA是编码，存储和转移生物学信息的遗传材料，也是生物细胞内的四种生物大分子之一。近年来，随着DNA纳米技术的高速发展，多种设计精妙、结构精确表征的DNA纳米结构(包括DNA四面体、DNA八面体、DNA纳米管、DNA折纸等)相继涌现，这种DNA纳米技术由于在其纳米尺度的精准可控已成为自组装领域的一项重要的技术手段，在纳米材料组装制备、纳米反应器、生物传感、药物控释等领域都展示了重要的应用前景。研究表明，许多DNA纳米结构很容易地进入细胞，并具有很高的细胞摄取效率。参考文献可见LiJ.,FanC.H.,PeiH.,etal,Adv.Mater.,2013,25,4386-4396。基于这些DNA纳米结构为开发具有多功能性的智能药物输送纳米载体提供了广阔前景。目前已报道有Ce6、TMPyP4等多种卟啉类化合物已被广泛用作光敏剂，因为卟啉类化合物具有很高的吸光能力并在高能量的激发下反应释放能量实现电子的转移。参考文献可见如HuaL.,NagaoK.,Chem.Rev.2016,116,6184-6261。由于卟啉类化合物的卟吩环和G-四分体平面尺寸相互匹配存在π-π堆积作用，卟啉能促进G-四链体的形成并能对其产生稳定作用。曾报道的一种水溶性阳离子卟啉TMPipEOPP，已报道它能在单链DNA、双链DNA存在下特异性识别G-四链体。参考文献可见ZhuL.-N.,ZhaoS.-J.,WuB.,etal,PloSOne,2012,7,e35586。这就为水溶性阳离子卟啉TMPiPEOPP作为以G-四链体为靶点的PDT光敏剂奠定了重要基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服目前光敏剂存在的被动靶向、生物相容性差等缺点，提供利用水溶性阳离子卟啉化合物——四碘化5,10,15,20-四{4-[2-(1-甲基-1-哌啶)乙氧基]苯基}卟啉(以下简称TMPiPEOPP)与“DNA纳米灯笼”(DNA纳米结构)相结合，并应用于制备具有生物兼容性好的可识别肿瘤细胞的纳米PDT光敏剂，该纳米PDT光敏剂具有能够自组装形成、对细胞低暗毒性、高光毒性、无需强制性释放光敏剂的要求以及有良好的EPR效应等特点。本专利技术借助G-四链体KRAS(序列为AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGGGAGG，摩尔消光系数为341000L·mol-1·cm-1)的特异性结合形成TMPipEOPP/KRAS复合光敏剂，并使其具有一定的靶向性。在复合光敏剂中引入DNA纳米结构，通过将KRAS序列一段延伸出25个碱基(序列为：TTTTTGTTTTTGTTTTTTTTTTTTT)变成P3-KRAS后，通过碱基互补配对原则，P3-KRAS中延伸出来的序列可以与DNA纳米结构中伸展出来的序列互补配对自组装形成一种新型的具有EPR效应的纳米复合光敏剂，使这种超分子纳米复合光敏剂能够在肿瘤细胞内稳定地存在并富集，从而进一步探究其在肿瘤细胞的光动力效果。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种通过水溶性阳离子卟啉制备PDT纳米光敏剂中的方法，包括以下步骤：(1)将浓度均为1μM的A1、A2、P1、P2四条寡核苷酸序列在含有25mMMgCl2和10mMTris-HCl的缓冲溶液(pH7.0)中混合，形成一种混合物A；将混合物A放入基因扩增仪(PCR)中加热至95℃维持5min，随即放置在冰上温育10min；即制备好DNA纳米灯笼；(2)将2μMP3-KRAS稀释在10mMTris-HCl缓冲溶液(pH7.0)和10mMKCl溶液中，形成一种混合物B；将混合物B放入基因扩增仪中加热至95℃维持5min，之后迅速将温度降至25℃孵育0.5h；而后，向混合物B中再加入2μMTMPipEOPP，并充分混匀，得到复合光敏剂TMPipEOPP/P3-KRAS；(3)将上述制备好的1μM的DNA纳米灯笼和2μM的复合光敏剂TMPipEOPP/P3-KRAS混合，形成混合物C；将混合物C放入基因扩增仪中保持37℃温育1h；温育后，加入2mMNa2EDTA形成混合物D，将混合物D并放入基因扩增仪中继续保持37℃温育1h；然后，将得到的混合物D在温度为4℃、转速为14000rpm环境下离心15min；用超纯水洗涤三次获得纳米复合光敏剂TMPipEOPP/P3-KRAS-DNA纳米灯笼，简称DNA-NPs，并将DNA-NPs重悬于10mMTris-HCl缓冲溶液(pH7.0)中以备使用。(4)利用紫外-可见光谱、动态光散射(DLS)和Zetapotential、透射电镜验证上述纳米复合光敏剂的形成。还提供一种水溶性阳离子卟啉化合物在制备PDT纳米光敏剂中的应用，所述水溶性阳离子卟啉化合物的结构式为：化学名为：四碘化5,10,15,20-四{4-[2-(1-甲基-1-哌啶)乙氧基]苯基}卟啉，简称TMPipEOPP。一种水溶性阳离子卟啉化合物在制备PDT纳米光敏剂中的应用实验方法，包括以下步骤：(301)通过细胞对纳米复合光敏剂DNA-NPs进行摄取和共聚焦荧光成像；(302)对活细胞内产生的单线态氧进行检测；(303)进行细胞毒性实验。进一步的，步骤(301)具体如下：将DNA-NPs(其中TMPipEOPP浓度为0.5μM)与HeLa细胞共同孵育1h，4h，8h后，用PBS洗3次以除去未摄取的药物，然后用4％多聚甲醛固定细胞15min；激光共聚焦成像使用OlympusIX-81显微镜进行成像，选择458nm作为二极管泵浦激光器激发波长。进一步的，步骤(302)具体如下：2',7'-二氯荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过水溶性阳离子卟啉制备PDT纳米光敏剂中的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将浓度均为1μM的A1、A2、P1、P2四条寡核苷酸序列在含有25mM MgCl
【技术特征摘要】
1.一种通过水溶性阳离子卟啉制备PDT纳米光敏剂中的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将浓度均为1μM的A1、A2、P1、P2四条寡核苷酸序列在含有25mMMgCl2和10mMTris-HCl的缓冲溶液(pH7.0)中混合，形成一种混合物A；将混合物A放入基因扩增仪(PCR)中加热至95℃维持5min，随即放置在冰上温育10min；即制备好DNA纳米灯笼；
(2)将2μMP3-KRAS稀释在10mMTris-HCl缓冲溶液(pH7.0)和10mMKCl溶液中，形成一种混合物B；将混合物B放入基因扩增仪中加热至95℃维持5min，之后迅速将温度降至25℃孵育0.5h；而后，向混合物B中再加入2μMTMPipEOPP，并充分混匀，得到复合光敏剂TMPipEOPP/P3-KRAS；
(3)将上述制备好的1μM的DNA纳米灯笼和2μM的复合光敏剂TMPipEOPP/P3-KRAS混合，形成混合物C；将混合物C放入基因扩增仪中保持37℃温育1h；温育后，加入2mMNa2EDTA形成混合物D，将混合物D并放入基因扩增仪中继续保持37℃温育1h；然后，将得到的混合物D在温度为4℃、转速为14000rpm环境下离心15min；用超纯水洗涤三次获得纳米复合光敏剂TMPipEOPP/P3-KRAS-DNA纳米灯笼，简称DNA-NPs，并将DNA-NPs重悬于10mMTris-HCl缓冲溶液(pH7.0)中以备使用；
(4)利用紫外-可见光谱、动态光散射(DLS)和Zetapotential、透射电镜验证上述纳米复合光敏剂的形成。
2.一种水溶性阳离子卟啉化合物在制备PDT纳米光敏剂中的应用，其特征在于，所述水溶性阳离子卟啉化合物的结构式为：
化学名为：四碘化5,10,15,20-四{4-[2-(1-甲基-1-哌啶)乙氧基]苯基}卟啉，简称TMPipEOPP。
3.一种水溶性阳离子卟啉化合物在制备PDT纳米光敏剂中的应用实验方法，其特征在于，包括以下步骤：
(301)通...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱莉娜，楚俊卿，孔德明，王东霞，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。