EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术公开的人源抗体具有如SEQ ID NO.6‑8所示的轻链CDR和SEQ ID NO.11‑12所示的重链CDR。该人源抗体可以特异性结合人EGFR和EGFRvIII两种蛋白，具有较高的亲和力，且其为全人源抗体，具有更低的免疫原性，本发明专利技术为以EGFR为靶点的相关癌症的治疗提供了一种新的抗体选择。

【技术实现步骤摘要】
EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种人EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用。
技术介绍
EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。它是由原癌基因c-erbB1编码的一种多功能跨膜糖蛋白，分子量约为170kD，由1186个氨基酸组成，分为胞内区、胞外区和跨膜区，EGFR人体内分布非常广泛，在哺乳动物上皮细胞、胶质细胞、成纤维细胞等细胞膜上均有表达，EGFR其它家族成员还包括HER2、HER3和HER4。EGFR及其家族成员在细胞生长、增殖、分化、存活和迁移中均起着非常重要生理调控作用。EGFR在多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌和前列腺癌)存在突变或高表达，与肿瘤发生、发展和恶性增值密切相关，并因此成为目前最为成功的肿瘤治疗靶点之一，适用于肺癌、消化道等多种肿瘤治疗。EGFR突变主要有四种形式，包括基因扩增、框内缺失、串联重复和点突变，EGFR突变体III(EGFRvariantIII，EGFRvIII)最常见突变形式之一，成为神经系统肿瘤诊疗潜在靶点，也可见于多种类型肿瘤，目前为止，尚未在正常组织中检出EGFRvIII，EGFRvIII是相关肿瘤诊断的重要标识。特别是近年来，抗体药物治疗迅猛发展，业已成为肿瘤免疫治疗的重要工具，全球范围内，EGFR是热门靶点，至今已有多个EGFR抗体批准进入临床，包括西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥珠单抗和尼妥珠单抗，它们对肿瘤治疗适应症和应用呈上升态势，在这些上市的EGFR单抗中，只有帕尼单抗(Panitumumab)可以同时中和EGFRvIII和野生型EGFR抗体，减弱细胞内活化信号，具有显著的体外和体内肿瘤活性。但目前这些抗体中，不少抗体仍具有鼠源蛋白成分，易产生抗鼠抗体反应，反复应用时会影响效能，鉴于人源抗体药物发展大趋势，制备特色人源EGFR单克隆抗体，在EGFR靶向的免疫导向治疗中，则具有更好应用价值和前景。目前全人源抗体的获得仍不易。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用，本专利技术所提供的人源抗体可以特异性结合EGFR和EGFRvIII两种蛋白，具有较高的亲和力，且该抗体为全人源抗体，具有更低的免疫原性，为EGFR为靶点相关癌症治疗提供一种新的抗体选择。除非另外定义，在此使用的所有技术术语、注释以及其他科学术语或科学术语是旨在具有本专利技术涉及领域普通技术人员所通常理解的含义。在一些情况中，为了清楚和/或为了便于引用在此定义了具有通常理解含义的术语，并且在此包括这类定义不必解释成表示与本领域通常理解的具有显著差异。在此说明或引用的许多技术和步骤被本领域普通技术人员良好地理解并且使用常规方法一般性地使用。除非另外说明，通常地根据制造商限定的实验方案和/或参数来执行涉及使用可商购的试剂盒和试剂的步骤。一方面，本专利技术提供一种抗EGFR或EGFRvIII的全人源抗体或其抗原结合片段，所述人源抗体或其抗原结合片段均具有如SEQIDNO.6-8所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及如SEQIDNO.11-12所示的重链CDR1、CDR2和CDR3。目前人源化抗体已经彻底取代鼠源抗体的治疗应用，主要是通过鼠源抗体的人源化实现，而全人源抗体则成为新一代治疗性抗体发展的大趋势。全人源抗体技术主要有转人Ig基因鼠、抗体库技术和单个B细胞技术。噬菌体库技术具有更好的可操作性，其中诱导性抗体库，有助于获得特定目标抗原针对性抗体，提高成功率。本专利技术选择肺癌患者为主体，入组了较大样本量，构建肺癌B细胞来源的噬菌体单链抗体库，从中筛选得到上述抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体。该人源抗体对EGFR和EGFRvIII均具有特异性结合能力，具有双特异性特点，且该人源抗体对EGFR和EGFRvIII蛋白具有较高的亲和力以及检测灵敏度，由于该人源抗体的序列均为人源序列，其应用于人体靶向EGFR相关的癌症治疗时，不容易引起体内的异源蛋白免疫反应，本专利技术为靶向EGFR提供了一种新的抗体选择。术语“抗体”特别地是指包含通过二硫键连接的至少两个重链和两个轻链的蛋白质。术语“抗体”包括天然产生的抗体以及抗体的重组形式，例如，在原核生物中表达的抗体、未糖基化的抗体、人源抗体和嵌合抗体。每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包含三个或-在IgM-或IgE-型抗体的情况下-四个重链恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一个恒定结构域CH1与可变区相邻，并且可以通过铰链区连接第二个恒定结构域CH2。轻链恒定区仅由一个恒定结构域组成。可变区可以进一步细分成超可变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布更保守的区域，称为框架区(FR)，其中每个可变区包含三个CDR和四个FR。然而，根据本专利技术的术语“抗体”还包括如重链抗体(即，抗体只由一个或多个(特别是两个)重链组成)和纳米抗体(即，抗体只由单个单体可变结构域组成)这样的抗体。术语“人源抗体”特别地是指其中至少一个CDR源自人抗体并且其中恒定区(如果存在)和可变区的至少一个框架区源自人抗体或人抗体共有序列的抗体。优选地，重链可变区的所有CDR，或更优选地，重链可变区和轻链可变区的所有CDR，源自人抗体。此外，优选重链可变区的所有框架区，或更优选地，重链可变区和轻链可变区的所有框架区源自人抗体或人抗体共有序列。CDR优选源自相同的非人抗体。一个可变区的头三个或所有框架区优选源自相同的人抗体或人抗体共有序列，然而，重链可变区的框架区不是必须源自与轻链可变区的框架区相同的人抗体或人抗体共有序列。目前最优化的非异源蛋白抗体是，其全部序列均来自于人的免疫球蛋白基因，包括来自转人Ig转基因鼠和直接从人体获取的B细胞来源的抗体基因全序列，这样抗体称为“全人源”抗体，或简称为“人源”抗体。可选地，在本专利技术的一些实施方式中，所述人源抗体或其抗原结合片段具有如SEQIDNO.9所示的轻链可变区和SEQIDNO.13所示的重链可变区。可选地，在本专利技术的一些实施方式中，所述人源抗体的重链恒定区选自人IgG、人IgM、人IgE、人IgA或人IgD的重链恒定区。可选地，在本专利技术的一些实施方式中，所述人IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。可选地，在本专利技术的一些实施方式中，人IgA为IgA1或IgA2。可选地，在本专利技术的一些实施方案中，所述人源抗体的重链恒定区如SEQIDNO.17的第141-470位所示。可选地，在本专利技术的一些实施方案中，所述人源抗体的轻链恒定区选自人κ型轻链或人λ型轻链的恒定区。可选地，在本专利技术的一些实施方案中，所述人源抗体的轻链恒定区如SEQIDNO.15的第133-239位所示。人源抗体的恒定区可以源自任何人抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体或其抗原结合片段均具有如SEQ ID NO.6-8所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及如SEQ IDNO.11-12所示的重链CDR1、CDR2和CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体或其抗原结合片段均具有如SEQIDNO.6-8所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及如SEQIDNO.11-12所示的重链CDR1、CDR2和CDR3。


2.根据权利要求1所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体或其抗原结合片段具有如SEQIDNO.9所示的轻链可变区和SEQIDNO.13所示的重链可变区。


3.根据权利要求2所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源抗体的重链恒定区选自人IgG、人IgM、人IgE、人IgA或人IgD的重链恒定区；
优选地，所述人IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；
优选地，所述人IgA为人IgA1或人IgA2；
优选地，所述人源抗体的重链恒定区如SEQIDNO.17的第141-470位所示；
优选地，所述人源抗体的轻链恒定区选自人κ型轻链或人λ型轻链的恒定区；
优选地，所述人源抗体的轻链恒定区如SEQIDNO.15的第133-239位所示。


4.根据权利要求1-3任一项所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。


5.根据权利要求1-3任一项所述的抗EGFR或EGFRvIII的人源抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述EGFRvIII的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


6.权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段在制备以EGFR为靶点治疗癌症的药物中的应用。


7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述癌症为EGFR和/或EGFR突变体III表达呈阳性的癌症；
所述癌症选自胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、结肠癌、肝癌或膀胱癌；
优选地，所述胶质细胞瘤为神经胶质细胞瘤；
优选地，所述结肠癌指转移性结直肠癌；
优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。


8.一种治疗癌症的药物，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。


9.一种检测EGFR或EGFRvIII的试剂，其特征在于，其含有权利要求1-5任一项所述的人源抗体或其抗原结合片段。


10.一种表...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪涛，易玲，闫卓红，王小珏，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11