具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0‑300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接，同时具有结合钠离子通道以及整合素受体的能力，促进皮肤修复、代谢更新、增强淡斑减少皱纹效果，涉及其制备方法，采用高密度发酵、超耐受金属亲和层析纯化、特异性蛋白酶切除标签、离子柱精制纯化方法，得到的重组纤连蛋白rFN不含纯化标签、纯度高、比活力高，制备过程简单高效、低成本、适用大规模生产，还涉及其在体外贴壁细胞培养、皮肤损伤修复、除皱、淡斑的应用。

【技术实现步骤摘要】
具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白、及其制备方法和应用。
技术介绍
芋螺肽(Conopeptides)是海洋腹足纲软体动物芋螺的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，芋螺肽的主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物。芋螺肽能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型，还可以作用于钙、钠、钾等多种离子通道。芋螺肽有镇痛以及舒缓神经紧张的作用，同时不具有成瘾性，因此是一种药物领域的研究热点。近年已经开始运用于美容领域，主要作用为减弱皱纹。由于芋螺肽分子量较小、表达较困难，目前国内外主要通过化学合成方法来制备，但这种化学合成的方法操作复杂、成本高、不适合规模化生产，且化学合成得到的芋螺肽结构与天然芋螺肽的结构有区别。纤连蛋白是一种细胞外基质蛋白，调控了细胞的迁移、粘附、生长、增殖、组织的再生、伤口的修复，在医疗以及美容等方面有重要用途，现有的纤连蛋白虽然可以应用于美容方面，但是其在松弛皱纹、淡斑方面的效果比较有限。单分子的纤连蛋白上存在多种结构域，分别具有不同的功能，如包括12个纤连蛋白I型重复位点FnI结构域、2个纤连蛋白II型重复位点FnII结构域、15-17个纤连蛋白III型重复位点FnIII结构域。近年来，由于对纤连蛋白功能结构域的研究深入以及重组表达技术的突破，纤连蛋白已经解决了重组表达的问题，主要是分离纤连蛋白具有不同功能的结构域，进行重新组合，获得具有不同功能的小分子化类人纤连蛋白。重组纤连蛋白的制备涉及到较为复杂的纯化问题，目前重组纤连蛋白的单位体积培养基表达量还在较低的2g/L的水平，远远落后于胶原蛋白，纯化工艺效率低、成本高，影响重组类人纤连蛋白的应用范围。目前重组蛋白多采用亲和填料层析进行纯化，使用较多的是金属亲和(IMAC)纯化填料，其中镍金属亲和填料已经发展到第三代，分别以三配位亚胺二乙酸(IDA-NI)、四配位胺三乙酸(NTA-NI)以及五配位(SMART-NI)为配基。使用金属亲和填料纯化，通常需要在目的蛋白上引入6个组氨酸标签，即His-tag标签，这一标签最小只有6个氨基酸残基，水溶性好，通常不影响蛋白的结构与功能，在制药或者其它His6-tag具有不利影响的用途方面，需要移除His-tag标签，但是移除His-tag是一个巨大困难，常规的解决办法是在His6-tag与目的蛋白之间引入一个蛋白酶的酶切位点，粗纯化后的融合蛋白经过特定蛋白酶的加工，可以切除标签，通常使用凝血酶(Thrombin)、活化凝血十因子(FactorXa)、烟草花叶病毒蛋白酶TEV等进行切割，但这些酶往往存在特异性不够，会在目的蛋白序列内切开甚至切割以后会留下冗余氨基酸残基；近年来有人发现真核生物的类泛素蛋白SUMO可以特异性的被一种空间识别特异性的蛋白酶ULP1加工，这一过程具有最高底物特异性以及切割效率，如果将SUMO连接到目的蛋白的N端，ULP1蛋白酶切割以后，可以完美的解决切割效率、切割特异性以及冗余残基的问题。目前还未见使用芋螺肽与纤连蛋白的FN功能片段融合表达的策略，进行芋螺肽的表达、提高纤连蛋白在松弛皱纹、淡斑方面的效果、并进行规模制造重组纤连蛋白的报道。且尚未见到使用第三代超耐受镍柱纯化重组纤连蛋白，达到简化纯化工序、提高纯化效率的策略，也未见到使用SUMO/ULP1体系构建融合重组纤连蛋白进而制备重组纤连蛋白的策略。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术的第一个目的是提供具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，旨在采用生物技术进行芋螺肽的表达，提高纤连蛋白在松弛皱纹、淡斑、促进皮肤修复方面的效果，并进行规模制造重组纤连蛋白rFN。其技术方案为：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，所述重组纤连蛋白序列包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0-300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接。优选地，所述钠离子通道结合肽段来自于天然芋螺肽的Mu-CnIIIC片段，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列为QGCCXXXXXCSSXXCBDHZRCCGRR，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列中的X为氨基酸残基的任一种，B为碱性残基Lys、Arg中的任一种，Z为小侧链残基Gly、Ala、Ser中的任一种。优选地，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码核酸序列如SEQIDNO.4所示。优选地，所述RGD结构域为天然纤连蛋白的FnIII-10结构域，所述FnIII-10结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码核酸序列如SEQIDNO.2所示，所述SEQIDNO.1氨基酸序列内含有Arg-Gly-Asp的三个连续氨基酸残基序列，用于与细胞特定类型的整合素受体结合，所述多肽连接片段为天然纤连蛋白的FnIII-8、FnIII-9结构域。优选地，所述重组纤连蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，编码核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。本专利技术的第二个目的是提供上述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，使用第三代超耐受镍柱纯化重组纤连蛋白rFN，采用SUMO/ULP1体系构建融合重组纤连蛋白rFN，达到简化纯化工序、提高纯化效率的策略。其技术方案为：具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)载体构建：截取天然纤连蛋白的所述RGD结构域与多肽连接片段，以所述多肽连接片段连接所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段，获得重组纤连蛋白rFN的编码DNA，将所述重组纤连蛋白rFN的编码DNA接入pSmart-I载体中，获得融合蛋白His-SUMO-rFN的重组表达载体pSmart-I-rFN质粒。(2)摇瓶表达：将所述重组表达载体pSmart-I-rFN质粒转入大肠杆菌表达菌株，摇瓶鉴定，获得阳性工程菌。(3)规模发酵：将所述阳性工程菌接种至培养基中培养，得到种子液，将所述种子液接种到发酵培养基中发酵、加入诱导剂诱导表达，离心得到发酵菌泥。(4)超耐镍亲和纯化：将步骤(3)中得到的发酵菌泥均质破碎，离心过滤处理，上柱进行第三代超耐镍亲和纯化，得到洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN。(5)酶切回挂除去标签、离子柱精制纯化：取步骤(4)获得的洗脱后的融合蛋白His-SUMO-rFN，加入ULP1蛋白酶用于切除纯化标签His-SUMO，得到酶切后的重组纤连蛋白rFN缓冲液，稀释缓冲液后回挂超耐受镍柱，合并穿出液与冲洗液，采用低盐PB缓冲液进行离子交换填料精纯、洗脱。优选地，所述纯化标签His-SUMO的SUMO部分的N端包含一段用于纯化的组氨酸标签，所述组氨酸标签含有大于或等于6个His氨基酸残基，所述纯化标签His-SUMO的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，编码核酸序列如SEQIDNO.6所示。优选地，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于，所述重组纤连蛋白序列包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0-300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接。/n

【技术特征摘要】
1.具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于，所述重组纤连蛋白序列包括至少一个可以和细胞整合素受体结合的RGD结构域、至少一段可作用于钠离子通道的钠离子通道结合肽段，所述RGD结构域与所述钠离子通道结合肽段之间用包含0-300个氨基酸残基的多肽连接片段进行连接。


2.如权利要求1所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述钠离子通道结合肽段来自于天然芋螺肽的Mu-CnIIIC片段，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列为QGCCXXXXXCSSXXCBDHZRCCGRR，所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列中的X为氨基酸残基的任一种，B为碱性残基Lys、Arg中的任一种，Z为小侧链残基Gly、Ala、Ser中的任一种。


3.如权利要求2所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述Mu-CnIIIC片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码核酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.如权利要求1-3任一所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述RGD结构域为天然纤连蛋白的FnIII-10结构域，所述FnIII-10结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码核酸序列如SEQIDNO.2所示，所述SEQIDNO.1氨基酸序列内含有Arg-Gly-Asp的三个连续氨基酸残基序列，用于与细胞特定类型的整合素受体结合，所述多肽连接片段为天然纤连蛋白的FnIII-8、FnIII-9结构域。


5.如权利要求4所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白，其特征在于：所述重组纤连蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，编码核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。


6.如权利要求1所述的具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)载体构建：截取天然纤连蛋白的所述RGD结构域与...

【专利技术属性】
技术研发人员：单玉飞，张开岳，左胜涵，吴雅勤，张贵锋，孔英俊，陈江，
申请(专利权)人：江苏邦特生物科技有限公司，中国科学院过程工程研究所，中科华启北京生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32