一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法，属于分析检测技术领域。本发明专利技术的荧光探针具体化学结构如式(Ⅰ)所示。该荧光探针能够对植物叶片表面噬菌体产生的角质酶进行特异性、抗干扰性检测，且在与角质酶发生反应后该探针的荧光颜色还会发生肉眼可见的红移，可以实现对角质酶的比率型检测。其次，该探针还可广泛的应用于液体环境、气体环境、以及化学品种角质酶的检测。同时，该探针具有稳定性好，且对角质酶的检测具备高灵敏度、高选择性以及特异性的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法
本专利技术涉及一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法，属于分析测试

技术介绍
角质酶是一种丝氨酸酯酶，此种酶主要作用于水解植物角质中存在的酯键，同时也可作用于如长链脂肪酸、短链脂肪酸的酯类。角质酶可以被细菌、真菌及人工合成等方式产出。角质酶是一种具有α/β水解折叠的共同结构框架的蛋白质，由不同病菌产生出的角质酶其组成结构基本相同。同时，角质酶属于诱导酶，主要成分为糖蛋白，一般是以O-糖苷键与碳水化合物结合。角质酶目前主要的应用领域较为狭窄，主要是食品工业及纺织工业。多数真菌、细菌在感染植物前需通过一定的手段分解或者破坏植物叶片表面覆盖的角质层以使感染过程顺利进行。分泌角质酶作为一种能够有效分解植物叶片表面角质层的手段，是很多植物病菌感染植物的必要步骤，例如：烟草赤星病菌、稻瘟病菌等。由于分泌角质酶步骤存在于病菌对植物产生实际伤害之前，所以研究对角质酶的快速检测技术对植物保护及相关病害定性、预警具有重要的实际意义。目前对植物病害的检测手段主要有噬菌体法、血清技术、电镜技术和PCR诊断技术。噬菌体是一种能够侵染病菌的物质，可以通过具有特异性的单价噬菌体完成对病菌的检测与定性。血清技术是通过抗体和抗原特异性结合来实现对病菌快速定性和检测技术。电镜方法是将电子显微镜与血清技术相结合的一种方法。该技术可以分辨出形态相似但不同种的病毒，是一种在超微和分子水平上可以对植物病原物的形态、结构进行研究的精密技术。聚合酶链式反应(PCR)，是一种体外扩增特异性DNA技术。应用PCR扩增技术可将很少的病原微生物扩增放大，以此来达到检测病害的目的。虽然现有的植物病害检测技术已经能够实现对植物病害快速地、准确地检测，不同的方法都具有不同的检测优势。但是，这些检测手段的实施无不建立在精密、昂贵的检测仪器基础上。诸如电泳仪、电子显微镜和高效液相色谱等检测设备价格昂贵、操作复杂极大的影响了植物病害检测技术的推广与应用。此外，由于这些检测手段的专业性较强、检测过程复杂，检测工作只能由受过相关培训的专业人才进行。这也阻碍了现有的检测手段在病虫害检测过程中的应用，不利于相关技术的普及。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述植物病害检测领域中步骤繁琐，操作手段要求高的缺点，以角质酶为植物病害标志物，提供一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法，检测过程简便、快捷，结果判定直观，有利于非技术人员对该技术的掌握与运用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针，其具有如式(Ⅰ)所示结构：式(Ⅰ)所示探针为N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺，分子式为C28H27NO4，分子量为441.52。该探针为橘黄色无味固体粉末，易溶于二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醇等有机溶剂。本专利技术所示荧光探针是一个稳定的荧光团，在萘环的1位和8位上的酰胺基团为强力的吸电子基团，而萘环4位上的基团为强力的供电子基团，所以整个荧光探针就构成了一个典型“推-拉”电子的结构从而在荧光下呈现出绿色。当角质酶作用于该荧光探针时改变了萘环4位上取代基团的结构，从而导致整个分子的推拉电子效应变化，最终致使该探针的荧光颜色从绿色转变为橘黄色。在检测过程中，可将探针颜色变化的荧光强度比值作为检测信号从而达到比率型检测角质酶的目的。根据研究表明，如式(Ⅰ)所示荧光探针的最大吸光位置在377nm附近。以380nm波长的光作为激发光照射该探针，探针的荧光发射位置在520nm左右呈绿色。当角质酶与探针作用后，探针萘环4位上的酯键断裂致使探针体系的推拉电子效应变化，520nm处的荧光发射峰强度逐渐变小，同时在580nm处出现一个新的荧光发射峰并逐渐增强。在反应约40min后520nm处发射峰趋近于消失，而580nm处发射峰达到最大强度。至此荧光探针颜色完全转变为橘黄色。基于本专利技术的荧光探针具有对角质酶的特异性检测、选择性检测的能力。本探针能够在生物样品、环境样品、化学样品中完成对角质酶的快速、便捷的检测。第二方面，本专利技术提供了一种如式(Ⅰ)所示荧光探针的制备方法。其包括如下步骤：(1)以4-溴-1,8-萘二酰亚胺与正丁胺为原料制得如式(Ⅱ)所示N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺。(2)以N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺与4-乙酰氧基苯乙烯为原料制得如式(Ⅲ)所示N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。(3)将N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺置于KOH提供的碱性条件下制得如式(Ⅳ)N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。(4)将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺与丁酸酐反应后制得如式(Ⅰ)所示荧光探针。作为本专利技术所述荧光探针的制备方法的优选实施方式，所述荧光探针的制备方法包括以下步骤：(1)将4-溴-1，8-萘二酰亚胺溶解于乙醇中，随后加入正丁胺，在85℃条件下反应4小时。随后通过旋转蒸发除去乙醇得到固体粉末后经柱层析得到如式(II)所示N-正丁基-4-溴-1，8-萘二酰亚胺。(2)将N-正丁基-4-溴-1，8-萘二酰亚胺溶解于三乙胺与乙腈的混合溶液中，三乙胺与乙腈的体积比为7：3。随后加入4-乙酰氧基苯乙烯并在醋酸钯与三(邻甲苯基)膦的催化下于105℃反应12小时。反应完成后通过旋转蒸发除去溶剂，将所得固体粉末经柱层析得如式(Ⅲ)所示N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。(3)将N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺加入含有KOH的乙醇溶液中并在冰浴中搅拌20min，然后再于室温下继续反应5h。反应结束后，经旋转蒸发与柱层析所得固体粉末即为式(Ⅳ)所示成N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。(4)将N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺与丁酸酐置于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中于冰浴中先反应20min，随后撤去冰浴在室温下反应5h。反应后的溶液通过旋转蒸发的方式除去溶剂，所得固体粉末通过柱层析后得到如式(Ⅰ)所示荧光探针粉末。作为本专利技术所示荧光探针制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)-(5)中，均采用硅胶层析住对产物进行纯化。作为本专利技术所示荧光探针制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中按照每毫摩尔4-溴-1,8-萘二酰亚胺加入13.8毫升正丁胺的比例，将4-溴-1,8-萘二酰亚胺与正丁胺溶于乙醇溶液中。所述步骤(2)按照每毫摩尔N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺加入1.4毫摩尔4-乙酰氧基、0.006毫摩尔醋酸钯和0.004毫摩尔三(邻甲苯基)膦的比例依次加入三乙胺与乙腈的混合溶液中，其中三乙胺与乙腈的体积比为3:7。所述步骤(3)中按照每毫摩尔N-正丁基-4-(4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针具有如式(Ⅰ)所表示的结构。/n

【技术特征摘要】
1.一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针具有如式(Ⅰ)所表示的结构。


2.一种如权利要求1所述的可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以4-溴-1,8萘二酰亚胺和正丁胺为原料在氮气保护下制得如式(Ⅱ)所示的N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺；
(2)以步骤(1)所制得的N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺为原料，将原料与4-乙酰氧基苯乙烯在醋酸钯和三邻甲苯基膦的催化下反应制得如式(Ⅲ)所示的N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺；
(3)以步骤(2)所制得的N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺为原料，在KOH的乙醇溶液中(每1毫升乙醇中加入1mgKOH)中制得如式(Ⅳ)所示的N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺；
(4)以步骤(3)所制得的N-正丁基-4-(4-酚羟基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺为原料，将原料与丁酸酐共反应制得如式(Ⅰ)所示的荧光探针N-正丁基-4-(4-顶酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺；





3.如权利要求2所述的一种可用于检测植物叶片表面角质酶的荧光探针及其制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将4-溴-1,8-萘二酰亚胺溶解于乙醇溶液中，然后将正丁胺加入其中并在85℃的条件下反应4小时。然后经柱层析、旋转蒸发所得到的固体粉末即为N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺。
(2)将N-正丁基-4-溴-1,8-萘二酰亚胺按照3:7的溶解比例溶解于三乙胺与乙腈的混合溶液中。然后将4-乙酰氧基苯乙烯加入其中，在醋酸钯、。和三(邻甲苯基)膦的催化下于105℃反应12小时。反应完成后对其进行萃取、柱层析、旋转蒸发，所得固体粉末即为N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺。
(3)将N-正丁基-4-(4-乙酰氧基苯乙烯基)-1,8-萘二酰亚胺置于KOH的乙醇溶液中(每1毫升乙醇中加入1mgK...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯贤锋，高振忠，王晓波，陈凯，李锰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44