抗病草鱼的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及草鱼育种技术领域，尤其是涉及抗病草鱼的制备方法及应用。所述抗病草鱼的制备方法，包括以下步骤：①、选种；②、亲代感染养殖；③、准备精子和卵子；④、一代抗病草鱼苗育苗；⑤、一代抗病草鱼苗感染养殖；⑥、二代抗病草鱼苗育苗；⑦、筛选种苗以及⑧、纯系鉴定。经过上述制备方法获得的抗病草鱼，具有优异的抗病能力和存活能力，可用于大规模抗病草鱼的苗种生产，其成本低、育种周期短的特点，具有良好的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
抗病草鱼的制备方法及应用
本专利技术涉及草鱼育种
，尤其是涉及抗病草鱼的制备方法及应用。
技术介绍
草鱼属于鲤科草食性鱼类，是我国主要的淡水养殖鱼之一，在我国水产养殖业和国民经济中占有重要的地位，具有味美、生长快的特点。但在草鱼的人工养殖中，一、二龄草鱼病害较为严重，商品鱼养殖的平均成活率不到30％，严重降低了养殖的经济效益。与草鱼有关的疾病有草鱼出血病、肠炎病、烂鳃病等十几种，而草鱼出血病是最严重的疾病之一。草鱼出血病是由呼肠孤病毒(Reovirus)引起的一种急性传染病，主要对一、二龄的草鱼种形成危害。该病发病快、流行广、死亡率高，其组织病理变化主要表现为全身性小血管损伤和出血。呼肠孤病毒增殖的主要特征是在细胞质中进行复制、生物合成及装配等全过程。与其他病毒不同的是，这类病毒增殖的任一阶段都不在细胞核内进行。因此，关于草鱼抗病育种的研究，特别是在提高草鱼种抗病毒侵染力育种研究上，具有重大的意义。目前，用传统的遗传选育方法建立生物品种纯系需要经历数代连续近交选育。由于草鱼是大型鱼类，性成熟周期长达5年，用这种传统的遗传选育方法建立抗病草鱼品种纯系在生产实际中需要数十年甚至上百年的时间，耗费大量的人力、物力。而且，由于选育工程的规模很难包括所有可能的基因组合，所选育的品系很可能因近交衰退而消失，不能达到育种目标。细胞工程应用于鱼类研究起步于20世纪50年代末60年代初，在70、80年代有了较大发展。主要包括鱼类细胞核移植、染色体工程、细胞融合、细胞培养。目前在抗病草鱼品系培育方面主要集中于细胞核移植和细胞培养。其缺点在于移植或融合鱼细胞核后的存活鱼苗相当低，而且细胞核在移植或融合前，经过数次传代，有可能发生染色体非二倍体改变的情况。同时在体外培养细胞上进行遗传操作难度较大，到目前为止还没有形成一个抗病草鱼鱼种品系。真核基因分子克隆技术的建立，提供了从核苷酸水平了解鱼类基因结构的手段。采用重组技术制作转基因鱼获得成功，为定向遗传育种提供了方便。到目前为止，人们所得的转基因鱼并不是单位点遗传稳定的品系，转基因的定点整合和转基因鱼纯系的建立依然是解决这些问题的关键，这也是草鱼抗病育种所面对的问题。为此，能够快速培育出抗病能力强、成活率高的抗病草鱼，是目前急需解决的技术难颗。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的之一是提供一种抗病草鱼的制备方法，其能够快速培育出抗病能力强、成活率高的抗病草鱼。本专利技术的目的之二是提供一种抗病草鱼制备方法的应用，其利用上述制备方法获得的抗病草鱼具有抗病能力强、成活率高的特点。本专利技术的上述专利技术目的一是通过以下技术方案得以实现的：一种抗病草鱼的制备方法，包括以下步骤：①、选种：选取健康、体型匀称的性成熟雌亲代草鱼，做好标记，放入专用池塘中养殖；②、亲代感染养殖：往专用池塘中投入患有出血病的患病草鱼，患病草鱼对所有亲代草鱼进行感染，期间及时清除患病致死的亲代草鱼和患病草鱼；③、准备精子和卵子：选择与草鱼杂交致死的鲤鱼精子，用2-4倍体积0-4℃的Hank’s溶液稀释，置于两支15W紫外灭菌灯下16cm处，照射70min，照射过程中不断用摇床摇动精液并维持精液温度在0-4℃，得到遗传失活的鲤鱼精子；期间，对亲代草鱼进行人工催产，获得成熟的亲代草鱼卵子；④、用遗传失活的鲤鱼精子激活亲代草鱼卵子，精卵接触2min后，在4-6℃冷水中对被激活的草鱼卵子进行冷休克15min，控制亲代草鱼卵子的减数分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组均来自母本同源染色体、无父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼苗，即为一代抗病草鱼苗；⑤、一代抗病草鱼苗感染养殖：在一代抗病草鱼苗的一龄阶段，投入患有出血病的患病草鱼，对所有一代抗病草鱼苗进行感染，筛选出健康的雌性一代抗病草鱼苗，采用人工催产，养殖获得性成熟的一代抗病草鱼，之后，对一代抗病草鱼进行人工催产，获得成熟的一代草鱼卵子；⑥、二代抗病草鱼苗育苗：用遗传失活的鲤鱼精子激活一代草鱼卵子，精卵接触2min后，在4-6℃冷水中对被激活的草鱼卵子进行冷休克15min，控制一代草鱼卵子的减数分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组均来自母本同源染色体、无父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼苗，即为二代抗病草鱼苗；⑦、筛选种苗：在二代抗病草鱼苗的一龄阶段，再次投入患有出血病的患病草鱼，对二代抗病草鱼苗进行感染，筛选出健康的二代抗病草鱼苗，即为最终的抗病草鱼纯系；⑧、纯系鉴定：在抗病草鱼纯系群体中随机取30条个体的尾鳍样品，以及对照的鲤鱼和草鱼各一条的尾鳍样品，通过多态性分子标记对其基因组进行广泛的扫描分析和比较，确定抗病草鱼纯系基因组的纯合性和一致性，群体中无外源草鱼的混入后，才可用于大规模抗病草鱼苗种生产。通过采用上述技术方案，本申请通过三次人工致病以及人工诱导单性生殖，相对于传统育种模式，本申请利用人工催产促使两代草鱼苗性成熟，有效缩短草鱼养殖年限；相对于细胞工程育种和基因工程育种的模式，本申请草鱼的抗病性能具有良好的稳定性。其中，本申请在育苗一开始直接使用患病草鱼对亲代草鱼进行筛选，不但能够节约草鱼苗成长至性成熟的一个成长周期，还能提高一代抗病草鱼苗的存活率，以此达到节约育苗成本、提高抗病草鱼抗病能力和存活能力的效果。鲤鱼适应能力强，鲤鱼精子经受紫外线长达70min的体外照射而彻底破坏其遗传物质，但保留其激活草鱼卵子发育能力的技术条件。使用与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子经遗传失活处理但保留其激活草鱼卵子发育的能力，从而能简便、准确地鉴定经染色体人工加倍后所产生的草鱼雌性单性生殖纯合二倍体鱼苗，排除草鱼与异种鱼精子杂交而产生杂交后代的可能性，进而获得纯系且存活率高的子代草鱼。综上，经过上述制备方法获得的抗病草鱼，具有优异的抗病能力和存活能力，可用于大规模抗病草鱼的苗种生产，其成本低、育种周期短的特点，具有良好的市场应用前景。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：步骤③和⑤步骤中，所述人工催产方法为：对草鱼注射催产药物，获得发育成熟的卵子。通过采用上述技术方案，目前水产养殖规程中，催产药物能够有效加快鱼类的性成熟，大大缩短鱼类的生长周期，以此有效提高鱼类育种的效率。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：所述催产药物为促黄体素释放激素类似物LRH-A2和鱼类脑垂体PG按重量比2∶1混合而成。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：所述催产药物的注射量为：每kg雌性草鱼注射催产药物120μg。通过采用上述技术方案，在本申请中，使用上述重量比和注射量的催产药物时，能够在最短的时间内获得成熟优质的卵子，因此本申请将其作为优选。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：步骤①中，亲代草鱼的体重大于同龄草鱼平均体重10-20％。通过采用上述技术方案，体重大10-20％的草鱼相对于其他草鱼具有更大的体重增加率以及更加顽强的生命力，以此可以作为一个初步筛选，进一步提高一代抗病草鱼苗的抗病能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗病草鱼的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n①、选种：选取健康、体型匀称的性成熟雌亲代草鱼，做好标记，放入专用池塘中养殖；/n②、亲代感染养殖：往专用池塘中投入患有出血病的患病草鱼，患病草鱼对所有亲代草鱼进行感染，期间及时清除患病致死的亲代草鱼和患病草鱼；/n③、准备精子和卵子：选择与草鱼杂交致死的鲤鱼精子，用2-4倍体积0-4℃的Hank’s溶液稀释，置于两支15W紫外灭菌灯下16cm处，照射70min，照射过程中不断用摇床摇动精液并维持精液温度在0-4℃，得到遗传失活的鲤鱼精子；期间，对亲代草鱼进行人工催产，获得成熟的亲代草鱼卵子；/n④、一代抗病草鱼苗育苗：用遗传失活的鲤鱼精子激活亲代草鱼卵子，精卵接触2min后，在4-6℃冷水中对被激活的草鱼卵子进行冷休克15min，控制亲代草鱼卵子的减数分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组均来自母本同源染色体、无父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼苗，即为一代抗病草鱼苗；/n⑤、一代抗病草鱼苗感染养殖：在一代抗病草鱼苗的一龄阶段，投入患有出血病的患病草鱼，对所有一代抗病草鱼苗进行感染，筛选出健康的雌性一代抗病草鱼苗，采用人工催产，养殖获得性成熟的一代抗病草鱼，之后，对一代抗病草鱼进行人工催产，获得成熟的一代草鱼卵子；/n⑥、二代抗病草鱼苗育苗：用遗传失活的鲤鱼精子激活一代草鱼卵子，精卵接触2min后，在4-6℃冷水中对被激活的草鱼卵子进行冷休克15min，控制一代草鱼卵子的减数分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组均来自母本同源染色体、无父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼苗，即为二代抗病草鱼苗；/n⑦、筛选种苗：在二代抗病草鱼苗的一龄阶段，再次投入患有出血病的患病草鱼，对二代抗病草鱼苗进行感染，筛选出健康的二代抗病草鱼苗，即为最终的抗病草鱼纯系；/n⑧、纯系鉴定：在抗病草鱼纯系群体中随机取30条个体的尾鳍样品，以及对照的鲤鱼和草鱼各一条的尾鳍样品，通过多态性分子标记对其基因组进行广泛的扫描分析和比较，确定抗病草鱼纯系基因组的纯合性和一致性，群体中无外源草鱼的混入后，才可用于大规模抗病草鱼苗种生产。/n...

【技术特征摘要】
1.一种抗病草鱼的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、选种：选取健康、体型匀称的性成熟雌亲代草鱼，做好标记，放入专用池塘中养殖；
②、亲代感染养殖：往专用池塘中投入患有出血病的患病草鱼，患病草鱼对所有亲代草鱼进行感染，期间及时清除患病致死的亲代草鱼和患病草鱼；
③、准备精子和卵子：选择与草鱼杂交致死的鲤鱼精子，用2-4倍体积0-4℃的Hank’s溶液稀释，置于两支15W紫外灭菌灯下16cm处，照射70min，照射过程中不断用摇床摇动精液并维持精液温度在0-4℃，得到遗传失活的鲤鱼精子；期间，对亲代草鱼进行人工催产，获得成熟的亲代草鱼卵子；
④、一代抗病草鱼苗育苗：用遗传失活的鲤鱼精子激活亲代草鱼卵子，精卵接触2min后，在4-6℃冷水中对被激活的草鱼卵子进行冷休克15min，控制亲代草鱼卵子的减数分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组均来自母本同源染色体、无父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼苗，即为一代抗病草鱼苗；
⑤、一代抗病草鱼苗感染养殖：在一代抗病草鱼苗的一龄阶段，投入患有出血病的患病草鱼，对所有一代抗病草鱼苗进行感染，筛选出健康的雌性一代抗病草鱼苗，采用人工催产，养殖获得性成熟的一代抗病草鱼，之后，对一代抗病草鱼进行人工催产，获得成熟的一代草鱼卵子；
⑥、二代抗病草鱼苗育苗：用遗传失活的鲤鱼精子激活一代草鱼卵子，精卵接触2min后，在4-6℃冷水中对被激活的草鱼卵子进行冷休克15min，控制一代草鱼卵子的减数分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组均来自母本同源染色体、无父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼苗，即为二代抗病草鱼苗；
⑦、筛选种苗：在二代抗病草...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗琛，张轩杰，杨辉，
申请(专利权)人：湖南海博水产种业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43