一种肝纤维化大鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及了一种肝纤维化大鼠模型的构建方法，其包括步骤一、选取5周龄的BALB/c小鼠构建模型；步骤二、采用体积百分比浓度为50％的四氯化碳溶液灌胃小鼠；步骤三、灌胃5周，每周灌胃2次，获得肝纤维化的小鼠。本发明专利技术通过构建与人类肝纤维化病因、病程和病理相似的实验动物模型，筛选和预测防治肝纤维化的有效药物，证明药物在防治肝纤维化上的医药用途、药理作用，评价相关药物对疾病的药效。

【技术实现步骤摘要】
一种肝纤维化大鼠模型的构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及了一种肝纤维化大鼠模型的构建方法。
技术介绍
肝纤维化指各种病因作用下肝内纤维增生，可伴有纤维隔形成。肝纤维化主要是一种病理概念，系指肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积，所导致的肝脏结构和/或功能异常改变的病理变化。其病理机制也多是由于肝实质细胞坏死、导致肝脏网状支架塌陷而形成，是一种被动与不可逆的病理过程。构建与人类肝纤维化病因、病程和病理相似的实验动物模型，是筛选和预测防治肝纤维化甚至肝癌的有效药物的基础，于此基础，通过实验室试验包括动物试验的定性或者定量数据，证明药物在防治肝纤维化上的医药用途、药理作用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供了一种肝纤维化大鼠模型的构建方法。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决：一种肝纤维化大鼠模型的构建方法，其包括以下步骤：步骤一、选取5周龄的BALB/c小鼠构建模型；步骤二、采用体积百分比浓度为50％的四氯化碳溶液灌胃小鼠；步骤三、灌胃5周，每周灌胃2次，获得肝纤维化的小鼠。作为优选，所述的四氯化碳溶液溶剂为橄榄油。作为优选，灌胃一次CCl4溶液的用量按照小鼠重量采用为0.5ml/kg灌胃。本专利技术由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：本专利技术通过构建与人类肝纤维化病因、病程和病理相似的实验动物模型，筛选和预测防治肝纤维化的有效药物，证明药物在防治肝纤维化上的医药用途、药理作用，评价相关药物对疾病的药效。附图说明图1是本实施例中过表达miR-142-3p对T淋巴细胞内铁死亡标志物表达的影响结果示意图。图2是本实施例中过表达miR-142-3p对Gln转运和xCT相关蛋白表达水平的影响结果示意图。图3是本实施例中miR-142-3p与SLC3A2之间的靶向关系。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1一种肝纤维化大鼠模型的构建方法，其包括以下步骤：步骤一、选取5周龄的BALB/c小鼠构建模型；步骤二、采用体积百分比浓度为50％的四氯化碳溶液灌胃小鼠；步骤三、灌胃5周，每周灌胃2次，获得肝纤维化的小鼠。本实施例中所述的四氯化碳溶液溶剂为橄榄油。灌胃一次CCl4溶液的用量按照小鼠重量采用为0.5ml/kg灌胃。本专利技术提供了一种肝纤维化小鼠模型在筛选、预防、制备肝纤维化治疗药物的应用。首先，制备一种转染miR-142-3p抑制物的骨髓间充质干细胞外泌体，具体制备方法，包括以下步骤：步骤一、将不含外泌体血清的培养基加入到骨髓间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养；步骤二、在细胞培养瓶中加入miR-142-3p抑制物和转染试剂后再继续培养；步骤三、收取培养后的上清液，然后通过离心法提取外泌体。其中，步骤二中培养环境为先在温度为37℃、氧体积浓度0.5％，CO体积浓度5％的混合气体中培养24小时；再在温度为37℃、CO体积浓度5％、氮气体积浓度95％的混合气体中培养48小时。步骤一中的培养基为含有丙酮酸钠110mg/L、谷氨酰胺10-30mM以及胎牛血清10％的低糖DMEM培养基。然后对获得肝纤维化的小鼠模型腹腔注射转染miR-142-3p抑制物的骨髓间充质干细胞外泌体，连续注射12天，采用8只小鼠为一组，对照组注射同等体积的生理盐水与1％DMSO的混合物。治疗时机：第四次灌胃后24小时，开始注射转染miR-142-3p抑制物的骨髓间充质干细胞外泌体。实验结果分析。(1)实验组与对照组中过表达miR-142-3p对T淋巴细胞的ROS和MDA的表达情况如图1所示，结果显示，相比于实验组，过表达miR-142-3p显著上调T淋巴细胞中ROS水平和MDA含量。(2)实验组与对照组中过表达miR-142-3p对Gln转运和xCT相关蛋白表达水平的影响如图2所示，RAPI蛋白裂解液提取各组T淋巴细胞中总蛋白，采用Westernblotting检测Gln转运体相关蛋白(SLC38A1和SLC1A5)和胱氨酸/谷氨酸逆转运体(xCT)相关蛋白(SLC7A11和SLC3A2)的表达水平，结果显示，相比于实验组，对照组中过表达miR-142-3p显著上调SLC3A2的表达水平，但对SLC38A1、SLC1A5和SLC7A11的表达水平无明显影响(P>0.05)。其中Westernblotting实验的具体步骤如下：采用RAPI蛋白裂解液提取各处理组细胞总蛋白，并采用BCA法进行蛋白浓度定量。每组取蛋白80μg进行SDS-PAGE电泳，然后将目的条带转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入1:1000比例稀释的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，5min/次；再加入1:5000比例稀释的HRP标记的二抗，室温孵育2h，TBST洗涤3次，5min/次，ECL染色，ImageJ分析条带灰度值。实验重复3次。(3)实验组与对照组中过表达miR-142-3p与SLC3A2之间的靶向关系如图3所示，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，结果显示，与实验组相比，对照组中荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。由此说明，miR-142-3p与SLC3A2具有直接靶向关系。上述实验结果编在HBV感染阳性肝癌外泌体中过表miR-142-3p，其对肿瘤浸润T淋巴细胞铁死亡和肝癌发展的影响，miR-142-3p通过靶向下调SLC3A2调控T淋巴细胞铁死亡，进而促进肝癌的发展。而本实施例中在获得肝纤维化的动物模型内注射转染miR-142-3p抑制物的骨髓间充质干细胞外泌体，其能够起到抑制miR-142-3p的过表达。实验组肝脏病理结构显示肝细胞变性减轻，胶原纤维沉积减少，肝小叶结构趋于正常。对照组肝脏病理结构显示肝细胞严重变性坏死，肝小叶结构紊乱，纤维增生明显，Masson三色胶原染色结果显示，转染miR-142-3p抑制物的骨髓间充质干细胞外泌体输注4周后较之对照组肝脏病理改善更为显著。总之，以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡依本专利技术申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本专利技术专利的涵盖范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝纤维化大鼠模型的构建方法，其特征在于其包括以下步骤：/n步骤一、选取5周龄的BALB/c小鼠构建模型；/n步骤二、采用体积百分比浓度为50％的四氯化碳溶液灌胃小鼠；/n步骤三、灌胃5周，每周灌胃2次，获得肝纤维化的小鼠。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝纤维化大鼠模型的构建方法，其特征在于其包括以下步骤：
步骤一、选取5周龄的BALB/c小鼠构建模型；
步骤二、采用体积百分比浓度为50％的四氯化碳溶液灌胃小鼠；
步骤三、灌胃5周，每周灌胃2次，获得肝纤维化的小鼠。

【专利技术属性】
技术研发人员：李立，胡宗强，
申请(专利权)人：李立，胡宗强，
类型：发明
国别省市：云南;53