一种油梨未成熟胚的体外拯救方法技术

本发明专利技术提供一种拯救油梨未成熟胚的方法，该方法包括：收集未成熟的油梨杂交果实，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；根据合子胚的成熟度，选择不同的培养基中促使合子胚的成熟；油梨种胚发芽后，在光照条件下长成正常的植株。本发明专利技术提供了一种油梨未成熟胚的体外培养拯救技术，当处于不同发育阶段的合子胚在体外条件下诱导成熟，成熟后诱导种胚萌发，形成健康植株的技术。本发明专利技术的技术可有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提供关键技术。

【技术实现步骤摘要】
一种油梨未成熟胚的体外拯救方法
本专利技术涉及一种经济果树育种领域，具体地涉及一种油梨未成熟胚的体外拯救方法。
技术介绍
油梨杂交育种是创造遗传变异、改良遗传特性，培育优良植物新品种的主要技术。通过油梨的种间杂交，可以将同一物种内的两个或多个优良性状集中在一个新品种中。另外，种间杂交还可以产生杂种优势，获得比亲本品种更强或表现更好的新品种。然而，油梨幼果具有很高的脱落率。利用杂交方法进行杂交，杂交的果实会大量落果，能正常在树上发育的很少，导致油梨杂交培育材料巨大丢失，这也是油梨杂交育种中存在的重大难题。本专利技术就这一难题进行了研究，提出一种解决脱落的杂交油梨果实合子胚拯救成熟的方法，从而有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提供关键技术。
技术实现思路
针对现在技术中存在的问题，本专利技术提供一种利用未成熟胚进行体外培养，从脱落的油梨果实中培养出成熟的油梨种子胚胎的方法。拯救后的油梨种子可以发芽并生长成正常的杂交油梨植株。在本专利技术中，“种胚”、“合子胚”、“胚体”均是指本专利技术的方法所拯救的核心对象，在本专利技术的语境下，这些术语可以互换。在不同的具体语境下，采用不同的术语。本专利技术的拯救未成熟的油梨种胚方法使用到的培养基包括：(1)基础培养基基础培养基是种胚萌发的基础营养液，由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分组成；(2)萌发培养基萌发培养基是种胚萌发的营养液，由基础培养基+6-苄胺基嘌呤(6-BA)+琼脂粉+蔗糖组成；(3)陪护培养基对于成熟度低于80％的油梨种胚，由于成熟度低，因此需要采用陪护培养基进行人工促进种胚的生长；陪护培养基由全强度或半强度的基础培养基+酪蛋白水解物或谷氨酸+琼脂粉+蔗糖组成。如图1所示，本专利技术的方法包括以下步骤：(1)外植体前处理收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；根据实践经验，判断合子胚的成熟度；对于胚成熟度为80％-100％的合子胚，直接萌发培养；对于成熟度为80％以下的合子胚，则先进行陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养；(2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基；其中，基础培养基的配方为：陪护培养基的配方a、b、c、d、e和f的配方如下：a.半强度的基础培养基300～500mg/L酪蛋白水解物8～12％椰子水8～12％蔗糖1～3g/L琼脂粉；以及b.半强度的基础培养基300～500mg/L谷氨酰胺8～12％椰子水8～12％蔗糖1-3g/L琼脂粉c.半强度的基础培养基300-500mg/L酪蛋白水解物8-12％椰子水4-6％蔗糖2-4g/L琼脂粉；以及d.半强度的基础培养基300-500mg/L谷氨酰胺8-12％椰子水4-6％蔗糖2-4g/L琼脂粉；e.基础培养基300-500mg/L酪蛋白水解物8-12％椰子水2-4％蔗糖4-6g/L琼脂粉；以及f.基础培养基300-500mg/L谷氨酰胺8-12％椰子水2-4％蔗糖4-6g/L琼脂粉；分别根据陪护培养基a、b、c、d、e和f的配方，将椰子水以外的各个成分加到容器中，搅拌，然后将各个培养基的pH调节至5.5-6.5，将培养基进行灭菌、冷却处理后，将过滤并灭菌后的椰子水加入冷却的灭菌培养基中，得到陪护培养基a、b、c、d、e和f；萌发培养基的配方为：基础培养基2.0-4.0μM6-苄胺基嘌呤(6-BA)4-8g/L琼脂粉2.5-3.5％蔗糖；(3)初始陪护培养基的选择根据不同的合子胚的成熟度选择相应的陪护培养基的配方；对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种作为初始陪护培养基；对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种作为初始陪护培养基；对于授粉后200天之后的种胚，选择陪护培养基e或f中的一种作为初始陪护培养基。另外，对于授粉后200天之后的种胚，是比较成熟的种胚，也可以采用萌发培养基直接进行萌发培养；(4)合子胚的陪护培养以及陪护培养基的选择和更换在合子胚的前心形期，采用陪护培养基a或b进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“初级陪护培养”)；当将合子胚培养到鱼雷期时，更换为陪护培养基c或d进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“一级陪护培养”)；在合子胚培养至成熟期时更换为陪护培养基e或f进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“陪护培养”)。将合子胚培养至成熟期的时间设定在10周内，在这10周内，无论是合子胚属于哪个成熟度，10周内基本都能通过陪护培养而培养至成熟期。随着合子胚成熟度的提高，需要不断更换陪护培养基。一般地，在针对某个成熟度的合子胚采用相应的陪护培养基进行培养，随着成熟度的提高，每隔3-4周后更换用于更高成熟度的陪护培养基。例如，在前心形采用陪护培养基a进行陪护培养，经过3-4周后，合子胚发展到了鱼雷期，此时，将陪护培养基更换为陪护培养基c进行进一步的陪护培养。经陪护培养，合子胚已发展到成熟期，然后进行萌发培养；未成熟合子胚的陪护培养在黑暗条件下进行。(5)萌发培养将上面陪护培养得到的种胚放入萌发培养基中，在25℃±1℃进行萌发培养，以维持合子胚的生长；在萌发培养期间进行光照培养，直至培养成正常生根小苗。在萌发期间，通过在陪护培养基上部分去除子叶诱导胚胎发芽；在15周期间进行发芽，大约每隔3周更换萌发培养基。根据本专利技术的方法，在步骤(1)中，对落果表面和种子进行灭菌处理。根据本专利技术的方法，所述灭菌处理包括：采用0.5v/v％次氯酸钠溶液中浸泡，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次；优选地，所述0.5v/v％次氯酸钠溶液还含有10滴/L的吐温20。根据本专利技术的方法，在步骤(2)中，所述萌发培养基的配方为：基础培养基2.22μM6-BA6g/L琼脂粉2.5-3.5％蔗糖；其中，所述基础培养基的配方为：根据本专利技术的方法，在步骤(2)中，陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方如下：a.半强度的基础培养基400mg/L酪蛋白水解物10％椰子水10％蔗糖2g/L琼脂粉；以及b.半强度的基础培养基400mg/L谷氨酰胺10％椰子水10％蔗糖2g/L琼脂粉c.半强度的基础培养基400mg/L酪蛋白水解物10％椰子水5％蔗糖3g/L琼脂粉；以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拯救油梨未成熟胚的方法，其特征在于，所述方法包括：/n(1)外植体前处理/n收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；选取成熟度为80％以下的合子胚，陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养；/n(2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基/n其中，基础培养基的配方为：/n

【技术特征摘要】
1.一种拯救油梨未成熟胚的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)外植体前处理
收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；选取成熟度为80％以下的合子胚，陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养；
(2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基
其中，基础培养基的配方为：






陪护培养基a、b、c、d、e和f的配方如下：
a.半强度的基础培养基
300～500mg/L酪蛋白水解物
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1～3g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
300～500mg/L谷氨酰胺
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1-3g/L琼脂粉
c.半强度的基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；
e.基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；
分别将椰子水以外的各个成分加到容器中，搅拌，然后将各个培养基的pH调节至5.5-6.5，将培养基进行灭菌、冷却处理后，将过滤并灭菌后的椰子水加入冷却的灭菌培养基中，得到陪护培养基a、b、c、d、e和f；
萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.0-4.0μM6-苄胺基嘌呤
4-8g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖；
(3)初始陪护培养基的选择
根据不同的合子胚的成熟度选择相应的陪护培养基的配方；
对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后200天之后的种胚，选择陪护培养基e或f中的一种作为初始陪护培养基；
(4)合子胚的陪护培养以及陪护培养基的选择和更换
在合子胚的前心形期，采用陪护培养基a或b进行陪护培养；当将合子胚培养到鱼雷期时，采用陪护培养基c或d进行陪护培养；在合子胚培养至成熟期时采用陪护培养基e或f进行陪护培养；
合子胚经陪护培养至成熟期后，采用萌发培养基进行萌发培养；
陪护培养在黑暗条件下进行；
(5)萌发培养
将陪护培养得到的种胚放入萌发培养基中，在25℃±1℃进行萌发培养；在萌发培养期间进行光照培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：王甲水，李艳霞，刘远征，马蔚红，臧小平，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院海口实验站，
类型：发明
国别省市：海南;46