一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：采集未开放花蕾，低温预处理24h‑48h，消毒，接种在培养基上；培养基为MS培养基，添加蔗糖、琼脂、激素；花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养。本发明专利技术的方法愈伤组织起动早，诱导率高，愈伤组织体积大，质地紧密。本发明专利技术为桔梗花药培养、单倍体育种、诱变育种等提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法
本专利技术属于植物学领域，具体涉及一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法。
技术介绍
桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.属于桔梗科、桔梗属多年生双子叶草本植物，为我国的大宗药材，需求量大，是一种药、食、赏兼用植物。桔梗根部入药，其主要活性成分是皂苷，具有镇咳、抗炎、降血压、降血糖、减肥、抗肿瘤、提高人体免疫力等广泛的药理活性。桔梗主要采用种子或无性扦插繁殖，但种子繁殖存在生产周期长，产量低，种子发芽率不高，扦插枝条成活率又很低，严重限制了生产的发展。组织培养技术在桔梗品种改良、种质保存、快速繁殖、基因转移等多方面得到广泛应用。桔梗组织在离体培养条件下，体细胞染色体更易发生各种变异，基因突变的频率也大为提高，这极大丰富了桔梗遗传资源，为药用植物改良开辟了新的途径。利用组织培养快繁技术可为桔梗栽培提供足量优质种苗；另外开展桔梗组织培养技术的研究，还可为桔梗其他方面的研究提供各种符合要求的材料。桔梗的茎尖、茎段和叶片离体材料均可诱导分化再生植株。李玉芬、弭晓菊利用组织培养技术对桔梗不同外植体根、茎、叶进行愈伤组织诱导及植株再生过程研究，成功地诱导桔梗产生愈伤组织并获得了分化苗。发现外植体根、茎、叶愈伤组织诱导的频率不同，并筛选出最佳的愈伤组织诱导的培养基及苗分化培养基。朱玉灵等对桔梗的茎尖、茎段、叶片进行离体培养和植株再生试验研究。舒娈、高山林的实验结果表明，桔梗试管苗可以较容易地诱导出愈伤组织，并且愈伤组织保持着较强的再分化能力。杨耀文、钱子刚等用上胚轴作为外植体进行桔梗组织培养的研究。向邓云以下胚珠、茎尖、茎段和根尖为外植体对桔梗愈伤组织诱导及不定芽形成进行了研究。结果表明在MS+2.4-D3.0mg/L+6-BA0.2mg/L的培养基上，下胚轴愈伤组织可形成丛生芽，不定芽分化能力较强；根尖愈伤组织芽分化能力次之；茎尖和茎段愈伤组织无芽分化。桔梗花属于两性花，据文献报道和套袋自交试验表明，在自然状态下桔梗的自交结实率低，结实主要靠异花授粉。桔梗的遗传育种研究进展缓慢，通过花药培养得到单倍体植株，再经染色体加倍得到纯合体，从中选出的优良纯系后代不分离,表现整齐一致,可缩短育种年限。在诱导频率较高时，单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可提供新的遗传资源和选择材料。愈伤组织是进行植物快速繁殖、原生质体制备、转基因研究中一个重要载体，可为其倍性育种、组培快繁、体细胞杂交、无性系变异以及遗传转化提供良好的试验材料，最终为桔梗的遗传改良提供重要基础。以往对桔梗不同外植体根、茎、叶进行愈伤组织诱导研究。桔梗花药大，数量多、开花期较长，为其进行花药培养提供了充分的材料，但国内外未见利用桔梗进行花药培养的相关报告。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法。本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：晴天午后采集未开放花蕾，用湿纱布包好，装入封口袋中黑暗环境下4℃低温预处理24h-48h，将花蕾用自来水加吐温20冲洗20min，75%乙醇浸泡30s，1%升汞消毒8-10min，在超净工作台无菌条件下用无菌水冲洗3-5遍，解剖镜下剥取花药，接种在培养基上；所述培养基为MS培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素，pH值为5.8，120-125℃下灭菌20min；所述激素为6-BA和/或2,4-D、NAA，所述6-BA浓度为0mg.L-1-2.0mg.L-1；所述2,4-D浓度为0mg.L-1-2.0mg.L-1；所述NAA浓度为0mg.L-1-0.2mg.L-1；花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养，温度为25±1℃。本专利技术提供的方法可在白花桔梗花药培养中应用。本专利技术提供的方法在白花桔梗花药培养中应用时，所述激素为1.0mg.L-16-BA和2.0mg.L-12,4-D。本专利技术提供的方法在白花桔梗花药培养中应用时，所述低温预处理的时间为48h。本专利技术提供的方法可在紫花桔梗花药培养中应用。本专利技术提供的方法在紫花桔梗花药培养中应用时，所述激素为1.0mg.L-16-BA、1.0mg.L-12,4-D和0.2mg.L-1NAA。本专利技术提供的方法在紫花桔梗花药培养中应用时，所述低温预处理的时间为24-48h。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，本专利技术的方法愈伤组织起动早，诱导率高，愈伤组织体积大，质地紧密。本专利技术为桔梗花药培养、单倍体育种、诱变育种等提供了基础。附图说明图1是图示低温预处理的不同时间对愈伤组织诱导的影响。具体实施方式实施例1桔梗花药培养诱导愈伤组织的试验No.1材料与方法No.1.1试验材料试验材料品种为白花桔梗（即BHJG）和紫花桔梗（即ZHJG），来自于山东农业大学药用植物园。No.1.2试验方法晴天午后采集未开放花蕾，用湿纱布包好，装入封口袋中黑暗环境下4℃保存1d（温度预处理材料除外），将花蕾用自来水加吐温20冲洗20min，75%乙醇浸泡30s，1%升汞消毒8-10min，在超净工作台无菌条件下用无菌水冲洗3-5遍，解剖镜下剥取花药，接种在培养基上。接种密度为15个花药/瓶，每处理三次重复，每重复三瓶。以MS培养基为诱导培养基，添加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8，120-125℃下灭菌20min。花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养，温度为25±1℃。30d后调查愈伤组织诱导率和组织块大小、质量，期间每一周观察一次愈伤组织生长情况。愈伤组织诱导率（%）=（形成愈伤组织数/接种花药数）×100%。No.1.2.1不同激素配比及浓度对愈伤组织诱导的影响分别以紫花桔梗和白花桔梗为试验材料，取单核靠边期的花药为外植体，分别接种在含6-BA、2,4-D、NAA不同浓度组合的愈伤组织诱导培养基上。接种后30d统计各处理的愈伤组织诱导率。三种激素均设三个水平，分别是：6-BA：0mg.L-1、1.0mg.L-1、2.0mg.L-1；2,4-D：0mg.L-1、1.0mg.L-1、2.0mg.L-1；NAA：0mg.L-1、0.1mg.L-1、0.2mg.L-1。采用L9（33）正交试验设计（表1、2）。No.1.2.2不同温度处理对愈伤组织诱导的影响以白花和紫花桔梗为供试材料，将采集的花蕾用湿纱布包裹，进行4℃低温处理1d、2d、3d，30d后比较各基因型诱导率高低。No.2结果与分析No.2.1不同激素处理对白花桔梗花药培养产生愈伤组织的影响以单核靠边期的花药为外植体，花药培养中常用的6-BA、2,4-D、NAA为外源激素，设置不同的水平进行试验。从表1看出，不添加任何外源激素的处理1诱导出愈率为0，而培养基中加入外源激素都能够显著的提高出愈率，通过对三种外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：晴天午后采集未开放花蕾，用湿纱布包好，装入封口袋中黑暗环境下4 ℃低温预处理24h-48h，将花蕾用自来水加吐温20冲洗20 min，75%乙醇浸泡30 s，1%升汞消毒8-10 min，在超净工作台无菌条件下用无菌水冲洗3-5遍，解剖镜下剥取花药，接种在培养基上；所述培养基为MS培养基，添加蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L、激素，pH值为5.8，120-125℃下灭菌20 min；所述激素为6-BA和/或2,4-D、NAA，所述6-BA浓度为0 mg.L

【技术特征摘要】
1.一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：晴天午后采集未开放花蕾，用湿纱布包好，装入封口袋中黑暗环境下4℃低温预处理24h-48h，将花蕾用自来水加吐温20冲洗20min，75%乙醇浸泡30s，1%升汞消毒8-10min，在超净工作台无菌条件下用无菌水冲洗3-5遍，解剖镜下剥取花药，接种在培养基上；所述培养基为MS培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素，pH值为5.8，120-125℃下灭菌20min；所述激素为6-BA和/或2,4-D、NAA，所述6-BA浓度为0mg.L-1-2.0mg.L-1；所述2,4-D浓度为0mg.L-1-2.0mg.L-1；所述NAA浓度为0mg.L-1-0.2mg.L-1；花药愈伤组织诱导期间进行黑暗培养，温度为25±1℃。


2.根据权利要求1所述的一种利用桔梗花药培养诱导愈伤组织的方法，其特征在于：所述方...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋振巧，李兴锋，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37