一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法及处理试剂技术

本发明专利技术涉及微生物分离及保存技术领域，特别是公开了一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，本发明专利技术通过使用改良的冻存液，并使用合适的分离方法，将菌群从粪便样品中分离出来，加以保存。这种处理方法可以降低粪便本身对菌群成分的影响，改良的冻存液能够延长菌群的可冻存时间。

【技术实现步骤摘要】
一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法及处理试剂
本专利技术涉及微生物分离及冻存
，具体公开了一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，同时还公开了处理用试剂。
技术介绍
人体肠道内含有种类丰富的微生物群体，其数量和种类已经被证明与人体多种疾病与健康状态有着紧密的关联。比如研究者发现抑郁症、阿尔茨海默症和糖尿病患者的肠道微生物菌群构成和数量与健康人群有着明显差异。改善肠道微生物菌群的构成和数量有着治疗相关疾病的可能。目前已经有给患者服用健康人群的粪便，改善患者肠道微生物菌群构成，以治疗疾病的案例。目前对人类粪便收集处理方法为：将收集的粪便样品置入合适大小的冻存管中，将样品置入液氮8～10秒，进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，-190～-210℃冻存。采用的冻存液是：称取甘油700～900g，加入100～300g双蒸水，搅拌稀释后，于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟。目前的人类粪便收集处理方法存在以下缺陷：(1)使用以甘油为基底的冻存液，在样品液氮保存30～40天后，将样品从液氮冻存容器中取出，使用标准解冻复苏方法，进行标准无菌培养，样品中微生物群落组成和新鲜样品的差异较大，约20％-40％。(2)收集的粪便样品不经过任何处理就进行直接冻存，在使用标准解冻复苏方法，进行标准无菌培养，发现样品中微生物群落组成和新鲜样品的差异也较大，粪便内的其它杂质对样品中微生物群落组成产生了影响。现有的处理方法导致粪便本身对菌群成分的影响较大，冻存之后的样品中微生物群落组成和新鲜样品产生了很大差异。基于国内目前还没有一套统一可靠的从粪便中提取肠道微生物并冻存的方法，因此有必要对其进行研究，以提出一种针对人类粪便微生物提取、冻存的可靠的处理方法。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，同时还提供了一种处理试剂。本专利技术方法具有操作简单、规范的优点，并能很好地保证人类的肠道微生物菌群构成与数量组成能够完好并不受污染的被分离和保存。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，包括以下步骤：(1)在50ml无菌离心管a中，加入0.8～1.6g的人类粪便样品，之后加入40ml的分离液，在旋涡混合仪上剧烈摇匀2～3min；其中所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟；(2)将所述无菌离心管a在1000-1500rpm、4℃下，离心4～6min，之后将无菌离心管a取出，将上清液倒入离心管b中，在10000-12000rpm、4℃下，将所述离心管b离心4～6min，之后抛弃上清液；对无菌离心管a离心时，在1000-1500rpm条件下进行，能够将粪便中一些不可见的有害颗粒也进行有效分离去除；(3)量取40ml所述分离液，加入所述无菌离心管a中，在旋涡混合仪上摇匀3～4min，之后所述无菌离心管a于1000-1500rpm、4℃下，再离心处理4～6min，之后取出，将所述无菌离心管a中的上清液倒入所述离心管b中，之后再将所述离心管b于10000-12000rpm、4℃下，离心处理4～6min，之后抛弃上清液；(4)依次重复步骤(2)、步骤(3)、步骤(2)、步骤(3)；(5)吸取所述离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中，并向所述无菌冻存管中添加1ml的冻存液，得到人类粪便肠道菌群样本；其中所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟。通过以上步骤(2)～(4)的处理，可以有效地将粪便中的细菌和粪便分离开，经检测，粪便残留物在分离后的菌液中含量不到1％。这样分离出的粪便微生物在以甜菜碱为主要成分的冻存液中可以更好的保存；而且这种分离的菌群在后期制作成药物或者辅助治疗产品时更为健康和安全。甜菜碱作为冻存液的主要组成部分时，对于细菌的保护作用更好，冻存一定时间后，细菌复苏后的存活率更高。进一步地，所述处理方法还包括样品冻存步骤，所述样品冻存步骤为：将所述步骤(5)得到的人类粪便肠道菌群样本置入液氮8～10秒进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，于-190℃～-210℃条件下冻存。作为一种优选的实施方案，所述人类粪便样品的含水量为65％～85％，密度为1.1～1.3g/cm3。作为一种优选的实施方案，所述人类粪便样品通过样品采集、样品封存、样品运输获得，其中所述样品采集是在粪便样品提供者排出粪便后0～3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品100-200g；优选采集粪便上层即最后排出的粪便样品。优选地，所述样品封存是使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。优选地，所述样品运输是将封存好的样品置于恒温箱中，在36～38℃下运输，运输时间控制在0～36小时内。本专利技术还提供了一种人类粪便肠道菌群样本的处理试剂，所述处理试剂包括分离液和/或冻存液，所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟获得；所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟获得。作为一种具体的实施方能，所述的人类粪便肠道菌群样本的处理方法，具体步骤如下：(1)样品采集：在粪便样品提供者排出粪便后0-3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品100-200g；粪便选取上层，最后排出的样品为佳。(2)样品封存：使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。(3)样品运输：将样品置于恒温箱中，温度设置为36-38摄氏度；运输时间限制在0-36小时内。(4)样品质检：对样品进行质量检测，检测项目包括含水量(65％-85％)，密度(1.1-1.3g/cm3)。(5)辅助溶液的配制：冻存液：称取甜菜碱(betaine)55g-65g，溶于950g-1050g双蒸水中，待溶解后，称取氯化钠(NaCl)8g-9g，加入溶解，121摄氏度，100-110千帕斯卡，灭菌20-25分钟。分离液：称取氯化钠(NaCl)8g-9g，溶于950g-1050g双蒸水，121摄氏度，110-120千帕斯卡，灭菌20-25分钟。(6)样品稀释：在50ml无菌离心管a中，加入0.8g到1.6g粪便样品，加入40ml分离液，旋涡混合仪上剧烈摇匀2-3min。(7)样品处理1：使用1000-1500rpm，4摄氏度，离心离心管a，4-6min；轻轻将离心管a取出(不要剧烈晃动)，将上清液倒入离心管b，10000-12000rpm，4摄氏度，离心4-6min，抛弃上清液。(8)样品处理2：量取40ml分离液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)在50ml无菌离心管a中，加入0.8～1.6g的人类粪便样品，之后加入40ml的分离液，在旋涡混合仪上剧烈摇匀2～3min；其中所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟；/n(2)将所述无菌离心管a在1000-1500rpm、4℃下，离心4～6min，之后将无菌离心管a取出，将上清液倒入离心管b中，在10000-12000rpm、4℃下，将所述离心管b离心4～6min，之后抛弃上清液；/n(3)量取40ml所述分离液，加入所述无菌离心管a中，在旋涡混合仪上摇匀3～4min，之后所述无菌离心管a于1000-1500rpm、4℃下，再离心处理4～6min，之后取出，将所述无菌离心管a中的上清液倒入所述离心管b中，之后再将所述离心管b于10000-12000rpm、4℃下，离心处理4～6min，之后抛弃上清液；/n(4)依次重复步骤(2)、步骤(3)、步骤(2)、步骤(3)；/n(5)吸取所述离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中，并向所述无菌冻存管中添加1ml的冻存液，得到人类粪便肠道菌群样本；其中所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟。/n...

【技术特征摘要】
1.一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在50ml无菌离心管a中，加入0.8～1.6g的人类粪便样品，之后加入40ml的分离液，在旋涡混合仪上剧烈摇匀2～3min；其中所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟；
(2)将所述无菌离心管a在1000-1500rpm、4℃下，离心4～6min，之后将无菌离心管a取出，将上清液倒入离心管b中，在10000-12000rpm、4℃下，将所述离心管b离心4～6min，之后抛弃上清液；
(3)量取40ml所述分离液，加入所述无菌离心管a中，在旋涡混合仪上摇匀3～4min，之后所述无菌离心管a于1000-1500rpm、4℃下，再离心处理4～6min，之后取出，将所述无菌离心管a中的上清液倒入所述离心管b中，之后再将所述离心管b于10000-12000rpm、4℃下，离心处理4～6min，之后抛弃上清液；
(4)依次重复步骤(2)、步骤(3)、步骤(2)、步骤(3)；
(5)吸取所述离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中，并向所述无菌冻存管中添加1ml的冻存液，得到人类粪便肠道菌群样本；其中所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟。


2.根据权利要求1所述的处理方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓政，王振宇，
申请(专利权)人：深圳市融思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44