使用荧光显微镜利用受激发射损耗对样本成像的方法技术

介绍一种使用荧光显微镜(10)利用受激发射损耗对样本(18)进行成像的方法，包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器(42)来控制所述荧光显微镜(10)，从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，用于受激发射损耗，由此在用所述照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对所述样本(18)予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围小于所述激发光分布的延展范围，且在所述样本(18)的目标区域内部连续地借助所述照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像(58)，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配。借助所述显微镜控制器(42)还适当地控制所述荧光显微镜(10)，从而在所述图像产生过程之前以第二位置分辨率产生所述目标区域的概览图像(48)，该第二位置分辨率小于所述第一位置分辨率且高于与所述激发光分布的延展范围相适配的第三位置分辨率，并且分析所述概览图像(48)，以便识别出无相关图像信息的图像区域，且在所述图像产生过程期间在扫描样本片段时至少减小所述去激发光分布的辐射功率，这些样本片段指配于在所述概览图像(48)中识别出来的无相关图像信息的图像区域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用荧光显微镜利用受激发射损耗对样本成像的方法
本专利技术涉及一种使用荧光显微镜利用受激发射损耗对样本进行成像的方法，包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器来控制荧光显微镜，从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，由此在用照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对样本予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围小于激发光分布的延展范围，且在样本的目标区域内部连续地借助照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配。本专利技术还涉及一种以此方式工作的荧光显微镜。
技术介绍
近来已开发出荧光显微的方法，其能实现以不受曾经由ErnstAbbe提出的光显微成像分辨率极限限制的位置分辨率对样本结构成像。所谓的受激发射损耗，简写为STED(StimulatedEmissionDepletion)，是能实现这种提高的位置分辨率的众多方法之一。对于STED-显微术，将激光束聚焦到样本中，以便把那里存在的荧光染料激发至发出荧光辐射。如此在样本中产生的激发光分布具有受到光学显微分辨率极限限制的空间延展范围，即不能任意地缩小。但为了能实现提高的位置分辨率，通过射入光给激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，所述光通过受激辐射使得激发的荧光染料去激发。下面也称为STED-光的去激发光分布与激发光分布一起形成照明焦点，该去激发光分布通常具有环形的强度分布，其中心为强度尽可能降至零的最小值。为了提高位置分辨率，使去激发光分布与激发光分布叠加，从而其中央的强度零位恰好位于激发光分布的强度最大值的区域内。在该中央的区域中，因而不会出现通过激发光分布被激发的荧光染料的由受激辐射引起的去激发。换句话说，在中央区域中，自发的荧光辐射不因去激发光分布而受到抑制。然而，在激发光分布的与前述中央区域邻接的外部区域中，却产生了对自发的荧光辐射的抑制，在这些外部区域中，叠加的去激发光分布的强度从零位起首先急剧地上升。结果，于是由激发光分布与去激发分布的叠加，如下样本区域产生了能提高分辨率的缩小，该样本区域可以通过激发光主要被激发至发出可用于图像产生的荧光。该样本区域的延展范围相比于激发光分布的延展范围明显减小，该样本区域在下面称为有效的激发焦点。前述情况在图1中示范性地示出。在此，图1示出了在STED-显微术中用于提高位置分辨率(图1中在x-方向上)的通常的光分布的横剖视图。在图1中，A表示激发光分布，B表示去激发光分布即STED-光。激发光分布A的唯一有激发作用的部分位于两条竖直线V之间的中央区域内部，其中，该部分的根据在中央区域内部的去激发光分布曲线而变化的激发有效性在图1中用曲线C表示。曲线C因而也反映了上述的有效激发焦点。在图1中还标明了饱和强度Isat。该饱和强度表示需要用来借助STED-光B通过受激辐射使得样本中含有的荧光染料完全去激发的强度。现在，图1中所示的光分布的问题是，STED-光B在中心必须具有零位，激发光分布在该中心具有其最大的强度，且同时尽量靠近该零位就已经提高至饱和强度Isat，以便把有效激发焦点限制到尽量小的样本区域。该受限制的样本区域规定了有效的点扩展函数，简写为PSF，进而规定了位置分辨率。STED-光的这种强度分布具有零位，且具有紧邻零位尽量急剧地提高到所需值Isat的强度，该强度分布目前却只能用比较高的辐射功率来产生，该辐射功率必然导致STED-光B的强度分布随着相距零位的距离增大而首先具有比Isat高多倍的强度。但是，伴随高的辐射功率必然产生的、对于荧光抑制本身并不需要的光强导致，被施加所述光强的样本区域遭受到特别高的光负荷，这造成荧光染料的严重的光褪色，并且还会在所检查的组织中引起损伤。因此，在通常的STED-图像产生过程期间，以根据图1的整个光分布对全部的待以最高分辨率成像的样本片段予以扫描，亦即尤其也在STED-光B的强度超调远离零位的情况下扫描，其中，光强大于饱和强度Isat。在通常的STED-显微方法中出现的光褪色使得往往无法多次对样本成像，比如以便随着时间的推移探测样本中的变化。通常，光褪色甚至如此之严重，乃至就连唯一的光栅图像都无法摄取，或者所摄取的图像含有很少的信号，致使难以分析。这尤其在三维的图像摄取过程中成问题，因为在此每个样本片段都非常频繁地受到光分布，进而特别严重地褪色。由现有技术已知一些解决方案，其涉及恰恰即使对于STED-应用也减轻光褪色。在这些解决方案之一中提出，在扫描过程期间针对每个像素或样本片段都在短暂的诊断时间内测量荧光信号是否高于预定的极限值。如果情况如此，则由激发光分布和STED-光组成的照明焦点仍保持被接通，并且针对该样本片段存储所检测的荧光信号。相反，如果在诊断时间内检测到的荧光信号低于极限值，则切断照明焦点，因为认为在这种情况下没有荧光染料位于STED-探测区域内。由此，位于STED-探测区域之外的荧光染料保持免受照明焦点的影响。在等人的“StrongsignalincreaseinSTEDfluorescencemicroscopybyimagingregionsofsubdiffractionextent”(PNAS2017，第114卷第9号，2125-2130)中，利用照明焦点仅对样本的很小的部分区域予以扫描。这些部分区域很小，致使所感兴趣的区域明显小于共焦的PSF。通过这种方式来确保所感兴趣的样本结构仅在直接邻接零位的区域中与STED-光分布接触，但其外部区域并不如此，STED-光分布在所述外部区域中具有特别高的强度。因而该方法只能用于很小的通常在150nm以下的图像区。另外，为了实施该方法，需要特殊的电光扫描仪，因为常用的机械式扫描仪不适合于这么小的图像区。在Heine等人的“Adaptive-illuminationSTEDnanoscopy”(PNAS2017，第114卷第37号，9797-9802)中提出了一种方法，在该方法中同样在STED-图像产生过程期间对来自于每个单独的样本片段的荧光信号予以分析。然而，在此并非在照明焦点的全额强度情况下分析信号。确切地说，照明焦点的辐射功率是逐步提高的。在这种逐个像素地实施的过程中，为了分析目的而对STED-光强进行的检测已经占用了一定的时间。然后才针对该像素进行真正的又占用时间的数据采集。由此产生了很长的总测量时间。因此，对于每个像素而言，照明焦点的停留时间在目前约为80～100μs。在摄取二维图像时，这导致80～100s的总测量时间，在像素边长为10nm时，二维图像的大小通常为10μmx10μm。在摄取三维图像时，对于每个单独的图像平面都会出现这种测量时间，这急剧地增加了时间耗费。这里要注意，在采用常见的机械式扫描仪时，通常无法直截了当地实现从一个未在其中探测到信号的像素快速地跳转到下一个像素，以便把在第一像素上的停留时间至少缩短用来读取图像信号的所需时间。这种跳转因而由于扫描仪的惯性会导致扫描过程中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用荧光显微镜(10)利用受激发射损耗对样本(18)进行成像的方法，包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器(42)来控制所述荧光显微镜(10)，/n从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，用于受激发射损耗，由此在用所述照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对所述样本(18)予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围与所述激发光分布的延展范围相比减小了，且/n在所述样本(18)的目标区域内部连续地借助所述照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像(58)，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配，/n其特征在于，借助所述显微镜控制器(42)还适当地控制所述荧光显微镜(10)，/n从而在所述图像产生过程之前以第二位置分辨率产生所述目标区域的概览图像(48)，该第二位置分辨率小于所述第一位置分辨率且高于与所述激发光分布的延展范围相适配的第三位置分辨率，并且分析所述概览图像(48)，以便识别出无相关图像信息的图像区域，并且/n在所述图像产生过程期间在扫描样本片段时至少减小所述去激发光分布的辐射功率，这些样本片段指配于在所述概览图像(48)中识别出来的无相关图像信息的图像区域。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171222 DE 102017131249.81.一种使用荧光显微镜(10)利用受激发射损耗对样本(18)进行成像的方法，包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器(42)来控制所述荧光显微镜(10)，
从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，用于受激发射损耗，由此在用所述照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对所述样本(18)予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围与所述激发光分布的延展范围相比减小了，且
在所述样本(18)的目标区域内部连续地借助所述照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像(58)，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配，
其特征在于，借助所述显微镜控制器(42)还适当地控制所述荧光显微镜(10)，
从而在所述图像产生过程之前以第二位置分辨率产生所述目标区域的概览图像(48)，该第二位置分辨率小于所述第一位置分辨率且高于与所述激发光分布的延展范围相适配的第三位置分辨率，并且分析所述概览图像(48)，以便识别出无相关图像信息的图像区域，并且
在所述图像产生过程期间在扫描样本片段时至少减小所述去激发光分布的辐射功率，这些样本片段指配于在所述概览图像(48)中识别出来的无相关图像信息的图像区域。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当扫描指配给在所述概览图像(48)中被识别出来的无相关图像信息的图像区域的样本片段时，附加地减小所述激发光分布的辐射功率。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述辐射功率减小至零。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，以所述第二位置分辨率产生所述概览图像(48)，其方式为，首先以小于所述第二位置分辨率的位置分辨率摄取原图像(44)，然后对所述原图像(46)进行能提高位置分辨率的图像处理。


5.如前述权利要求4所述的方法，其特征在于，产生所述原图像(44)，其方式为，借助所述激发光分布，以所述第三位置分辨率扫描所述目标区域。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过共焦的扫描成像来产生所述原图像(44)。


7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用宽视野照明来产生所述原图像(46)。


8.如权利要求4～7中任一项所述的方法，其特征在于，图像处理规定了对所述原图像(44)的反卷...

【专利技术属性】
技术研发人员：约纳斯·弗林，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE