一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法，属于BNP检测技术领域。它包括以下步骤：(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒；(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒；(3)制备适体修饰的SPR芯片；(4)SPR光学检测BNP。本发明专利技术使用灵敏的SPR技术检测极微量的目标物BNP，该方法利用抗体功能化修饰的磁纳米颗粒结合BNP，高特异适体修饰的金纳米颗粒进行高特异性筛选，起到双重选择的效果，同时通过级联缀合能形成大的复合物，从而连接在SPR芯片上，导致SPR角度的显著增大，能检测低至pg级的微量BNP；本发明专利技术同时结合特异性抗体和适体，改善了传统的抗原抗体法所出现的假阳性问题，检测时间短，操作方便。

【技术实现步骤摘要】
一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法
本专利技术涉及一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法，属于BNP检测

技术介绍
脑尿钠肽(BNP)是由心肌细胞分泌的由32个氨基酸组成的一种短肽，已作为标准的分子生物标志物在慢性心力衰竭(HF)的诊断和预后中提供重要生理病理信息。临床上以BNP100pg/ml作为临界值的隐形预测值达到90％，可以减少74％的临床不确定性；而BNP超过400pg/ml提示患者存在心力衰竭的可能性达到95％。由于BNP的含量低至pg级别和生物样本的复杂性，因此与其他心血管生物标志物相比，BNP的检测更具挑战性。另外，BNP具有20分钟的短的半衰期，这意味着需要高特异性的快速灵敏的对其进行检测。这可能也是迄今为止所报道的检测真实样本的BNP传感器数量有限的原因。目前已经开发了一些检测BNP的方法，包括试剂盒和荧光免疫测定等。试剂盒操作方便，但是在检测中容易出现假阳性的结果；荧光免疫法检测较为准确，但操作较为复杂，且灵敏度不高。因此限制了进一步的应用。表面等离子共振技术(SPR)是一种灵敏检测芯片上配位体与目标生物分子相互作用的领先技术，其应用SPR原理检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域。该技术检测过程方便快捷，灵敏度高，应用范围非常广泛，且可进行实时动态检测,这种方法成为生物分子相互作用研究中的既定工具，并且它被用于快速和灵敏地检测化学和生物分析物。表面等离子共振生物传感器(surfaceplasmonresonancebiosensor)，即SPR芯片，是基于生物分子在识别并形成复合物过程中，引起界面折射率变化与一定波长的入射光在界面形成的反射光衰减程度存在直接的相关性的原理而研制的一种光学检测仪器。而适体修饰的SPR芯片能够与目标物BNP结合，利用激光在SPR芯片上的折射率会发生改变，由此利用SPR的光学变化来灵敏的检测BNP。然而，对于在更加复杂的样本如血清中准确检测低至pg级别的BNP来说,常规的SPR方法应用受限。为了更好的增强SPR的响应以增大目标分子所产生的光学信号，将等离子体纳米结构与SPR相结合是一种吸引人的技术创新。近些年来，纳米材料技术迅速发展并被广泛应用于多个领域。纳米材料本身具有表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等优良特性，使其在发展新型高灵敏度、高稳定性、低成本生物传感器领域成为国内外研究热点。在各种类型的纳米粒子中，金纳米颗粒具有大的比表面积，高的表面自由能，可在颗粒表面固定大量的生物识别分子；近年来，磁性纳米粒子因具有利用外部静磁场有效分离复杂介质中分析物的能力引起了越来越多的关注，并逐渐应用于快速分离真实样本如血清或血液中的目标物。基于抗原抗体相互作用的酶联免疫吸附测定(ELISA)技术自开发以来在各分析领域应用广泛，取代了放射免疫测定，适用于各种测试，并且比放射免疫测定法更安全。然而，单纯依赖于抗体结合抗原来检测目标物具有一定缺点。除了不同批次抗体之间的差异外，还容易在检测中出现假阳性的结果。这些问题需要采用各种方法来改进单纯的ELISA方法，在不同选择中，探针模块化的适体与特异性的抗体相结合代替靶捕获剂是理想的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于：提供一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法，它解决了目前通过SPR传感器检测BNP时，由于目标物体积小，检测不够灵敏，以及传统抗原抗体法容易出现假阳性的问题。本专利技术所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法，它包括以下步骤：(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒：将BNP适体修饰在金纳米颗粒上；(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒：将BNP抗体修饰在磁纳米颗粒上；(3)制备适体修饰的SPR芯片：将BNP适体修饰在整个SPR芯片的金片上；(4)SPR光学检测BNP：a.向待测BNP溶液中加入过量的抗体功能化修饰的磁纳米颗粒，抗体功能化修饰的磁纳米颗粒通过BNP抗体与BNP溶液中的目标物BNP抗原完全结合；b.再向上述混合液中加入过量的特异性适体修饰的金纳米颗粒，特异性适体修饰的金纳米颗粒上的BNP适体进一步结合目标物BNP抗原的另一个位点，特异性适体修饰的金纳米颗粒、抗体功能化修饰的磁纳米颗粒与BNP抗原三者形成一个大的复合物；c.通过外部磁场进行磁分离，去除混合液中未结合的特异性适体修饰的金纳米颗粒，剩余复合物重悬于等量的磷酸缓冲盐溶液PBS中；d.将重悬后的混合液加入适体修饰的SPR芯片上进行特异性反应，反应时间10分钟，复合物中的金纳米颗粒上的BNP适体和SPR芯片上的互补链结合，将复合物链接到SPR芯片表面，之后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗，通过SPR仪器在SPR芯片上进行检测，得到检测结果。作为优选实例，所述特异性适体修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：a.选取粒径为20nm左右的金纳米颗粒；b.将质量浓度为0.05％的氯金酸溶液加入到装有回流冷凝装置的圆底烧瓶中，加热并快速搅拌，当氯金酸溶液沸腾20～30分钟后，一次性快速加入约3.5mL质量浓度为5％的柠檬酸三钠溶液，再持续加热150分钟，当溶液颜色逐渐变为酒红色之后，使其冷却至室温，用高速离心机对上述反应物进行离心(转速10000rpm，时间20～30min)，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，得到BNP适体溶液，于4℃储存备用；c.向990μL金纳米颗粒中加入10μLBNP适体溶液修饰，得到金纳米颗粒的修饰溶液，取上述金纳米颗粒溶液,用高速离心机进行离心(转速10000rpm，时间10～20min)，除去上清液，然后加入等体积的磷酸缓冲盐溶液PBS进行复溶，即可得到特异性适体修饰的金纳米颗粒。作为优选实例，所述抗体功能化修饰的磁纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：a.在体积为1mL、浓度为1mg/mL的磁纳米颗粒溶液，加入体积为10ul、浓度为1mg/ml的BNP抗体；b.用磷酸缓冲盐溶液PBS洗三次后,磁纳米颗粒与特异性的BNP抗体的体积比控制为(90～110):1，反应时间为20～30分钟；c.通过外部磁场对磁纳米颗粒进行磁分离，去除未结合的BNP抗体，弃上清液，磁纳米颗粒重悬于磷酸缓冲盐溶液PBS中，即得到抗体功能化的磁纳米颗粒。作为优选实例，所述适体修饰的SPR芯片制备方法，包括以下步骤：a.将SPR芯片的金片用水虎鱼洗液(98％H2SO4:30％H2O2＝3:1)浸泡30秒，之后用超纯水彻底清洗，氮气吹干备用；b.取100-200μL浓度为1μM的BNP适体溶液加到金片上，光反应30-50分钟，通过金-巯键将BNP适体的互补链修饰到SPR芯片表面，反应完成后，用超纯水清洗金片，氮气吹干，即得到适体修饰的SPR芯片。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术使用灵敏的SP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法，其特征在于，它包括以下步骤：/n(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒：将BNP适体修饰在金纳米颗粒上；/n(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒：将BNP抗体修饰在磁纳米颗粒上；/n(3)制备适体修饰的SPR芯片：将BNP适体修饰在整个SPR芯片的金片上；/n(4)SPR光学检测BNP：/na.向待测BNP溶液中加入过量的抗体功能化修饰的磁纳米颗粒，抗体功能化修饰的磁纳米颗粒通过BNP抗体与BNP溶液中的目标物BNP抗原完全结合；/nb.再向上述混合液中加入过量的特异性适体修饰的金纳米颗粒，特异性适体修饰的金纳米颗粒上的BNP适体进一步结合目标物BNP抗原的另一个位点，特异性适体修饰的金纳米颗粒、抗体功能化修饰的磁纳米颗粒与BNP抗原三者形成一个大的复合物；/nc.通过外部磁场进行磁分离，去除混合液中未结合的特异性适体修饰的金纳米颗粒，剩余复合物重悬于等量的磷酸缓冲盐溶液PBS中；/nd.将重悬后的混合液加入适体修饰的SPR芯片上进行特异性反应，反应时间10分钟，复合物中的金纳米颗粒上的BNP适体和SPR芯片上的互补链结合，将复合物链接到SPR芯片表面，之后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗，通过SPR仪器在SPR芯片上进行检测，得到检测结果。/n...

【技术特征摘要】
1.一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)制备特异性适体修饰的金纳米颗粒：将BNP适体修饰在金纳米颗粒上；
(2)制备抗体功能化修饰的磁纳米颗粒：将BNP抗体修饰在磁纳米颗粒上；
(3)制备适体修饰的SPR芯片：将BNP适体修饰在整个SPR芯片的金片上；
(4)SPR光学检测BNP：
a.向待测BNP溶液中加入过量的抗体功能化修饰的磁纳米颗粒，抗体功能化修饰的磁纳米颗粒通过BNP抗体与BNP溶液中的目标物BNP抗原完全结合；
b.再向上述混合液中加入过量的特异性适体修饰的金纳米颗粒，特异性适体修饰的金纳米颗粒上的BNP适体进一步结合目标物BNP抗原的另一个位点，特异性适体修饰的金纳米颗粒、抗体功能化修饰的磁纳米颗粒与BNP抗原三者形成一个大的复合物；
c.通过外部磁场进行磁分离，去除混合液中未结合的特异性适体修饰的金纳米颗粒，剩余复合物重悬于等量的磷酸缓冲盐溶液PBS中；
d.将重悬后的混合液加入适体修饰的SPR芯片上进行特异性反应，反应时间10分钟，复合物中的金纳米颗粒上的BNP适体和SPR芯片上的互补链结合，将复合物链接到SPR芯片表面，之后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗，通过SPR仪器在SPR芯片上进行检测，得到检测结果。


2.根据权利要求1所述一种使用高特异性和高灵敏性SPR芯片检测BNP的方法，其特征在于，所述特异性适体修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
a.选取粒径为20nm左右的金纳米颗粒；
b.将质量浓度为0.05％的氯金酸溶液加入到装有回流冷凝装置的圆底烧瓶中，加热并快速搅拌，当氯金酸溶液沸腾20～30分钟后，一次性快速加入约3.5mL质量浓度为5％的柠檬酸三钠溶液，再持续加热150分钟，当溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王沂，黄任强，董成，
申请(专利权)人：上海乐合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31