金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种金‑己硫醇‑介孔硅结构的SERS标记纳米探针及其制备方法与应用。本发明专利技术在4‑MBA标记的金纳米颗粒表面引入己硫醇和介孔硅，形成金‑己硫醇‑介孔硅结构的SERS标记纳米探针，利用己硫醇形成的分子间隔将信号分子固定以减弱其在激光热诱导下的趋热运动，形成更稳定的拉曼信号；包裹的介孔硅，形成类似分子筛结构，避免了细胞内部生物大分子对信号分子的影响，进一步提高了拉曼信号的稳定性和准确性。本发明专利技术的纳米探针可提前大量制备，操作时只需将纳米探针导入癌细胞中共同混合培养，结束后通过洗涤可马上进行检测：收集时间1s，然后从标准曲线上读出pH值，从而实现快速定量检测；可应用于早期癌症的临床诊断筛查。

【技术实现步骤摘要】
金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针及其制备方法与应用
本专利技术属于生物检测
，特别涉及一种金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针及其制备方法与应用，具体涉及一种基于介孔硅包裹的新型SERS基底监测细胞pH的方法。
技术介绍
细胞pH值作为体内微环境酸碱变化的重要参考，其数值可反映生理健康状况，影响着人体的生理和病理活动，并且与肿瘤的发生、发展有着密切关系，是目前研究的热点。目前监测细胞pH的方法主要有荧光法等，但这些方法由于其本身特性存在一定局限性，比如毒性、光漂白、操作复杂等，难以实现pH的精准监测，而由于细胞pH作为肿瘤诊前判定的重要依据，因此建立一种快速、简单、精确检测的方法具有非常重要的意义。表面增强拉曼散射(surfaceenhancedRamanscattering，SERS)技术是一种新颖的光谱技术，利用金银等金属表面显著增强的电磁场放大分子拉曼信号，可以用于生化检测分析。SERS标记具有以下优点，拉曼标记分子谱峰窄，分辨率高，拉曼散射几乎不受水的影响，不受光漂白影响且不容易发生光猝灭；由于SERS独特的优点，SERS纳米探针在生物成像，蛋白质检测，肿瘤识别等领域有重要应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针。本专利技术的另一目的在于提供上述金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种检测细胞pH值的方法。本专利技术采用己硫醇(HT)作为分子隔板，保证信号分子的稳定性，介孔二氧化硅包裹金纳米颗粒集成纳米探针，实现对肿瘤细胞内pH的监测。本专利技术的方法具有灵敏度高、普适性、检测过程简单、准确监测等特点。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法，包括如下步骤：(1)己硫醇作为分子隔板，通过该分子一端的-SH与金纳米颗粒结合，获得己硫醇改性的金纳米颗粒；(2)将步骤(1)获得的己硫醇改性的金纳米颗粒与拉曼信号分子4-MBA共同混合，在拉曼信号分子与金纳米颗粒间隙形成分子隔板，获得拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒；(3)将步骤(2)获得的拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒用活化剂活化表面，形成包裹位点，获得活化好的金纳米粒子；(4)采用One-pottwosteps法实现介孔硅对金纳米颗粒的包裹，先将步骤(3)活化好的金纳米粒子与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正硅酸四乙酯(TEOS)混合，在金纳米粒子表面形成致密的硅层(硅源)，作为还原模板，随后用氨水还原，在还原模板表面形成疏松的孔隙，形成金纳米粒子表面的介孔硅薄层，再洗涤除去多余的CTAB，获得介孔硅包裹的金纳米颗粒，即金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针。本申请所使用的分子隔板己硫醇是一种短链烷基硫醇，可以在金纳米颗粒表面达到较高的覆盖密度；同时由于分子隔板己硫醇的引入也使得纳米探针的拉曼信号更加稳定。步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径优选为25nm～35nm；更优选为30nm；优选的，步骤(1)中所述的己硫醇的溶液为新制己硫醇溶液，浓度为0.01～0.2mmol/L；优选为0.01～0.1mmol/L；更优选为0.1mmol/L；优选的，步骤(1)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5～1.5mmol/L；优选为1mmol/L。优选的，步骤(1)中所述的己硫醇与金纳米颗粒的体积混合比例为1：100～1：300，优选为1：200。优选的，步骤(2)中所述的拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸(4-MBA)；优选的，步骤(2)中所述的拉曼信号分子与己硫醇改性的金纳米颗粒的体积混合比例为1：20～1：100，优选为3：100。优选的，步骤(3)中所述的活化剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)；优选的，步骤(3)中所述的活化剂的溶液浓度为1～20μmol/L；更优选为10μmol/L。优选的，步骤(3)中所述的活化剂与拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒的体积混合比例为1：50～1：200，优选为1：100。步骤(4)中所述的One-pottwosteps法为一锅两步法；优选的，步骤(4)中所述的活化好的金纳米粒子与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正硅酸四乙酯(TEOS)的体积混合比例最优为100：5：2。优选的，步骤(4)中所述的CTAB的溶液浓度为10～200μmol/L；更优选为100μmol/L。步骤(4)中所述的氨水为氢氧化铵；步骤(4)中所述的氨水为体积分数为20～35％的氨水溶液；步骤(4)中所述的洗涤是用乙醇冲洗三次；一种金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针，通过上述制备方法制备得到。所述的金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针在检测细胞pH值中的应用。其中，所述的细胞优选为动物细胞。一种检测细胞pH值的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：(A)模拟体外检测，选取目标细胞或待测目标细胞培养；(B)将步骤(A)培养好的目标细胞与不同pH的缓冲液混合，获得不同pH的目标细胞溶液；(C)将步骤(B)获得的不同pH的目标细胞溶液分别与上述金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针共同培养，取出细胞进行拉曼探针信号采集；(D)根据不同pH值与拉曼信号强度的比值I1360/I1586的对应关系，并以I520归一化，以I1360/I1586/I520的数值建立标准曲线，从而利用拉曼信号比值对待测目标细胞的pH进行检测。优选的，步骤(A)中所述的目标细胞为动物细胞，更优选为小鼠乳腺癌细胞；优选的，步骤(B)中所述的不同pH的缓冲液为6、6.5、7、7.5、8、8.5。优选的，步骤(B)中所述的缓冲液为PBS缓冲液；优选的，步骤(C)中所述的不同pH的目标细胞溶液与金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的体积比值为2：1～1：3，优选为1：1，可各取10μL；优选的，步骤(C)中所述的培养的时间为5～8小时；更优选为6小时。步骤(C)中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得：所述的显微拉曼光谱仪的操作条优选为激发光源是波长为785nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为5mW，信号收集时间为1～10s(优选为1s)；步骤(C)中所述的信号是选取拉曼信号分子4-MBA的特征拉曼谱峰(1586cm-1)作为定量峰，并以对pH敏感的COO-振动峰(1360cm-1)作为变量峰，建立pH梯度对谱峰强度I1360/I1586比值的对应关系；同时采用归一化方法，利用I1360/I1586与硅片基底的特征峰(520cm-1)的拉曼强度比值作图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)己硫醇作为分子隔板，通过该分子一端的-SH与金纳米颗粒结合，获得己硫醇改性的金纳米颗粒；/n(2)将步骤(1)获得的己硫醇改性的金纳米颗粒与拉曼信号分子4-MBA共同混合，在拉曼信号分子与金纳米颗粒间隙形成分子隔板，获得拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒；/n(3)将步骤(2)获得的拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒用活化剂活化表面，形成包裹位点，获得活化好的金纳米粒子；/n(4)采用One-pot two steps法实现介孔硅对金纳米颗粒的包裹，先将步骤(3)活化好的金纳米粒子与十六烷基三甲基溴化铵CTAB和正硅酸四乙酯TEOS混合，在金纳米粒子表面形成致密的硅层，作为还原模板，随后用氨水还原，在还原模板表面形成疏松的孔隙，形成金纳米粒子表面的介孔硅薄层，再洗涤除去多余的CTAB，获得介孔硅包裹的金纳米颗粒，即金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)己硫醇作为分子隔板，通过该分子一端的-SH与金纳米颗粒结合，获得己硫醇改性的金纳米颗粒；
(2)将步骤(1)获得的己硫醇改性的金纳米颗粒与拉曼信号分子4-MBA共同混合，在拉曼信号分子与金纳米颗粒间隙形成分子隔板，获得拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒；
(3)将步骤(2)获得的拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒用活化剂活化表面，形成包裹位点，获得活化好的金纳米粒子；
(4)采用One-pottwosteps法实现介孔硅对金纳米颗粒的包裹，先将步骤(3)活化好的金纳米粒子与十六烷基三甲基溴化铵CTAB和正硅酸四乙酯TEOS混合，在金纳米粒子表面形成致密的硅层，作为还原模板，随后用氨水还原，在还原模板表面形成疏松的孔隙，形成金纳米粒子表面的介孔硅薄层，再洗涤除去多余的CTAB，获得介孔硅包裹的金纳米颗粒，即金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针。


2.根据权利要求1所述的金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径为25nm～35nm；
步骤(1)中所述的己硫醇的溶液浓度为0.01～0.2mmol/L；
步骤(1)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5～1.5mmol/L。


3.根据权利要求1所述的金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的己硫醇与金纳米颗粒的体积混合比例1：100～1：300；
步骤(2)中所述的拉曼信号分子与己硫醇改性的金纳米颗粒的体积混合比例为1：20～1：100。


4.根据权利要求1所述的金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的活化剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES；
步骤(3)中所述的活化剂的溶液浓度为1～20μmol/L；
步骤(3)中所述的活化剂与拉曼信号分子覆盖的金纳米颗粒的体积混合比例为1：50～1：200。


5.根据权利要求1所述的金-己硫醇-介孔硅结构的SERS标记纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的活化好的金纳米粒子与十六烷基三...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡勇军，张文建，江宁静，王棋，庄秀眉，王俊杰，余星星，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44