以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应制造技术

本发明专利技术提供了以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，是通过测定苜蓿品种接种根瘤菌株形成的地上生物量干重，分析生物量增长量效应，鉴别划分结瘤正向促生效应、结瘤无促生效应和结瘤负向促生效应，筛选正向促生效应的紫花苜蓿品种与根瘤菌株共生结瘤组合。本发明专利技术以生物量干重鉴别苜蓿与根瘤菌共生结瘤促生效应，提高了鉴定精准性和鉴定效率，结果稳定可靠，紧密结合生产实际，易于应用；此方法在精准鉴定筛选苜蓿品种与根瘤菌株接种组合的同时，利用形成的地上生物量干重的增长量效应明确划分了结瘤正向促生效应、结瘤无促生效应和结瘤负向促生效应，对苜蓿品种与根瘤菌株结瘤正向促生效应的精准筛选利用具有重要的指导意义。

【技术实现步骤摘要】
以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应
本专利技术属于农业领域，具体涉及以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应。
技术介绍
豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系是自然界效率最高的固氮体系，不同豆科植物与根瘤菌株间存在共生匹配专一性。紫花苜蓿与根瘤菌的共生匹配专一性，即某一根瘤菌株仅能与特定紫花苜蓿基因型或品种高效结瘤固氮，是二者共生效果的最主要决定因素。当二者专一性强时，接种根瘤菌的紫花苜蓿植株能够产生根瘤并高效固氮促生，以高效“共生”的方式为植物生长提供氮素营养，促生效应强；当二者专一性弱时，接种根瘤菌的紫花苜蓿植株不会产生根瘤，或者产生根瘤但只固定少量的氮甚至不固氮，根瘤菌以类似于“寄生”的方式消耗植物养分，促生效应差或者无促生效应。因此，快速、精准的鉴定紫花苜蓿与根瘤菌专一性共生体系及其促生效应是提高苜蓿产量和质量的重要途径。目前，对于苜蓿-根瘤菌共生组合促进生长效应的鉴定评价缺乏精准、快速简便的方法。温室盆栽和大田试验通常采用苜蓿品种接种根瘤菌株后测定占瘤率、結瘤数量、固氮酶活性、固氮量和株高等多个共生表型指标的方法评价筛选高效的共生组合，但因多个共生表型指标的选择缺乏统一的规范和标准，且易受环境条件的影响，存在工作量大、耗时长、效率低，尤其存在评价目标性不精准的问题，缺乏有效的指导意义。同时，以往的共生效应研究多关注高效共生结瘤，而实际上大多数根瘤菌与苜蓿品种共生对植物生长是无显著促进作用的，甚至还有部分根瘤菌存在“寄生”效应，只有少量根瘤菌能促进苜蓿生物量的增长，表现出共生增产效应。不管怎样，这样的根瘤菌-苜蓿共生组合均属于专一性范畴，但对这种正向或负向专一性的明确划分研究尚属空白。就经济利用和生态价值而言，地上生物量是实际生产中最受关注的指标，与未接种的对照相比，接种根瘤菌后植物地上生物量干重的增长量能够直观地体现双方的共生匹配效果，进而快速、精准的鉴别苜蓿品种与根瘤菌株结瘤共生的正向促生效应、无促生效应和负向促生效应，使优良苜蓿品种与优良根瘤菌株高效共生组合真正实现专一性精准促生增产增效。
技术实现思路
本专利技术提供了一种以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，有效的解决了上述
技术介绍
中存在的问题。本专利技术采用的技术方案如下：以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,包括：S1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；S2、制备根瘤菌液：将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；S3、接种根瘤菌株：将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；S4、测定指标：收获紫花苜蓿植株后处理，测定干重，并进行单因素方差分析和多重比较；S5、促生效应的确定：根据测定指标与对照组对比，判断促生效应。所述S1中紫花苜蓿使用紫花苜蓿品种MedicagosativaL.；根瘤菌株使用中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti。所述S1还包括：S101、挑选子粒饱满健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用碘伏溶液震荡灭菌，并用无菌水冲洗，于清水琼脂中催芽；S102、将河沙洗净过筛，pH调至中性后烘干灭菌，并冷却；S103、将紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽；S104、套制双层盆结构，双层盆之间浇灌灭菌水。所述S103中，紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽的条件为：光照时间16h·d-1，有光照时温度21～25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％。在第7d浇灌500mLHoagland有氮营养液。所述S2中，所述制备根瘤菌液包括将根瘤菌株TY平板活化后转接入TY液体培养基，振荡培养至菌液光密度OD600nm值为0.5～1，离心处理，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD600nm为0.5的根瘤菌液。TY液体培养基的制备方法为：胰蛋白胨5g·L-1；酵母粉3g·L-1；CaC12·6H2O1.3g·L-1；NaOH调试pH至7.0；121℃灭菌26min。所述S3中，接种根瘤菌株包括：S301、在幼苗生长至第15d左右时(95％幼苗出现第1片真叶出现)接种；S302、每株幼苗接种根瘤菌液1mL；S303、以浇灌不含根瘤菌的TY液体培养基为对照；S304、以每个菌株接种处理4个小盆作为重复；S305、接种根瘤菌株后，每隔7d在紫花苜蓿植株所在塑料面盆内浇灌Hoagland无氮营养液500mL。所述S4中，测定指标包括：S401、根瘤菌液浇灌接种45d后，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分；S402、每盆随机选取10株，以第一片对生子叶叶痕作为划分地上、地下部分的标准进行裁剪，将剪下的地上部分包入锡箔纸袋，两端开口，在烘箱中烘干到恒重，测定地上生物量干重；S403、采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan法对数据进行多重比较，p<0.05代表处理之间差异显著。所述S402中，在烘箱中烘干到恒重的烘干方式为：先在105℃烘箱中烘15min，再经80℃烘干到恒重。所述S5中，促生效应确定的判断标准为：标准1、当接种处理地上生物量干重大于对照组干重且p<0.05时，确定该根瘤菌株对苜蓿品种结瘤效应为正向促生效应，地上生物量干重增长量越大，增产效应越强；标准2、接种处理地上生物量干重与对照组干重相比p≥0.05时，确定该根瘤菌株对苜蓿品种结瘤无效应；标准3、当接种处理地上生物量干重小于对照组干重且p<0.05时，确定该根瘤菌株对苜蓿品种结瘤效应为负向促生效应，负向增长量越大，减产效应越强。本专利技术的有益效果为：1)以生物量干重确定共生结瘤促生效应，摆脱了对测定多个共生表型指标的依赖，方法成熟，操作规范，结果可靠，易于普及应用。2)生物量干重能最直观地体现共生结瘤促生效应，与实践结合紧密，说服力强。3)此方法将苜蓿品种与根瘤菌株共生结瘤的促生效应分为正向促生效应、无效应和负向促生效应，易于扬长避短，充分利用专一性“正效应”，克服专一性“负效应”，对根瘤菌与苜蓿品种共生结瘤促生效应的精准利用具有重要的指导意义。具体实施方式下面通过具体的实施例进一步的说明本专利技术的技术方案：实施例11)苜蓿品种：甘农9号紫花苜蓿(M.sativacv.GannongNo.9)品种。2)根瘤菌株：15株S.meliloti菌(表1)。表1根瘤菌株3)培育幼苗：挑选子粒饱满、健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用碘伏溶液(有效碘含量0.45％～0.55％(W·V-1))震荡灭菌3min，用无菌水冲洗5～6次，于清水琼脂中28℃催芽48h。将河沙洗净，过筛(2-mm)，pH调至中性后105℃烘干，121℃灭菌6h，冷却。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,其特征在于，包括：/nS1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；/nS2、制备根瘤菌液：将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；/nS3、接种根瘤菌株：将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；/nS4、测定指标：收获紫花苜蓿植株后处理，测定干重，并进行单因素方差分析和多重比较；/nS5、促生效应的确定：根据测定指标与对照组对比，判断促生效应。/n

【技术特征摘要】
1.以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应,其特征在于，包括：
S1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；
S2、制备根瘤菌液：将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；
S3、接种根瘤菌株：将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；
S4、测定指标：收获紫花苜蓿植株后处理，测定干重，并进行单因素方差分析和多重比较；
S5、促生效应的确定：根据测定指标与对照组对比，判断促生效应。


2.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S1中紫花苜蓿使用紫花苜蓿品种MedicagosativaL.；根瘤菌株使用中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti。


3.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S1还包括：
S101、挑选子粒饱满健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用碘伏溶液震荡灭菌，并用无菌水冲洗，于清水琼脂中催芽；
S102、将河沙洗净过筛，pH调至中性后烘干灭菌，并冷却；
S103、将紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽；
S104、套制双层盆结构，双层盆之间浇灌灭菌水。


4.根据权利要求3所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S103中，紫花苜蓿品种种子均匀植入含处理河沙盆中培养发芽的条件为：光照时间16h·d-1，有光照时温度21～25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％。在第7d浇灌500mLHoagland有氮营养液。


5.根据权利要求1所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：所述S2中，所述制备根瘤菌液包括将根瘤菌株TY平板活化后转接入TY液体培养基，振荡培养至菌液光密度OD600nm值为0.5～1，离心处理，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD600nm为0.5的根瘤菌液。


6.根据权利要求5所述的以生物量干重确定苜蓿与根瘤菌专一性共生结瘤促生效应，其特征在于：TY液体培养基的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：康文娟，师尚礼，刘畅，姚博，阿芸，尹国丽，祁娟，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62