基于荧光D型氨基酸代谢标记的抗菌药敏试验检测方法技术

本发明专利技术涉及了一种基于荧光D型氨基酸代谢标记的抗菌药敏试验检测方法，其利用荧光D型氨基酸代谢标记物标记与抗生素溶液混合孵育后的菌液，以根据其荧光信号强度获得抗生素最小抑制浓度。

【技术实现步骤摘要】
基于荧光D型氨基酸代谢标记的抗菌药敏试验检测方法
本专利技术涉及细菌代谢活性的评估方法以及抗菌药敏试验的检测方法，尤其是涉及基于荧光D型氨基酸代谢标记的抗菌药敏试验检测方法，用于快速评价或评测抗菌剂或细菌代谢活性，例如抗生素，对临床分离细菌菌株的抑菌效果，以指导临床用药。
技术介绍
随着抗生素在医疗及养殖等行业中的广泛使用，尤其是广谱抗生素的大量使用，已导致细菌耐药问题日益凸显，甚至陆续出现了可以抵抗几乎所有抗生素的超级细菌。细菌耐药性的产生和传播已引起全世界的普遍关注，被世界卫生组织认为是21世纪最大的公共卫生安全问题之一。解决这一问题的关键是及时地合理使用抗生素，不误用、不滥用，即应根据患者感染致病菌的种类，有针对性且适量地使用抗生素，而且这也能为病人提供更有效的治疗。目前最通用也是最有效的办法是通过抗菌药敏试验为临床上合理使用抗生素提供依据，信息包括致病菌对哪些抗生素敏感及相应的最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，MIC)。现有的抗菌药敏试验检测技术，如肉汤梯度稀释法、纸片扩散法、E-test法等，大多基于细菌是否生长增殖来评价抗生素的作用效果，通常需要较长时间的培养(一般大于8-16小时)以达到肉眼可分辨的菌量(浑浊度或抑菌圈)，才能评价药物的作用效果，其最主要的缺点是耗时太长，延误对临床合理使用抗生素的指导。即使通过自动化设备来简化操作流程，现有的设备，如Vitek、BDPhoenix、MicroscanWalkAway等是以细菌浑浊度为检测指标，虽然仪器给出的MIC准确率有所提高，但仍受细菌分裂增殖需要较长培养时间的限制(一般8-24小时)[参考文献1]。而且这些基于细胞生长增殖的检测方法还存在一个问题，即在其所测得的MIC浓度下的细菌可能会处于一种不生长但依然有代谢活性(non-growingbutmetabolicallyactive，NGMA)的状态，以此为依据进行给药，可能导致后期疾病复发[参考文献2]而反复用药。临床上，在尽可能短的时间内做出准确的诊断，并快速对症治疗，不管对细菌耐药问题的解决，还是对病患尤其是危重患者都有重大的意义。针对现有抗菌药敏试验方法耗时长的问题，新兴的快速抗菌药敏试验检测技术也在不断涌现，如基于微流控的细菌显微成像技术、RNA检测法、原子力显微镜悬臂法以及基于细菌代谢的拉曼信号检测等方法。这些方法的检测机制各不相同，大体包括：细菌生长增殖、形态变化、转录组变化和代谢活性检测等，借助各种仪器设备可以在2-8小时内完成抗菌药敏试验，判断细菌对抗生素的敏感性，甚至定量地给出MIC。但这些方法仍存在大量不足之处。例如，基于微流控的细菌显微成像技术大部分可直接观察细菌在抗生素作用下的生长增殖或形态变化，是一个可视化的检测方法，更直观，且借助微流控技术可使检测所使用的样品和试剂量大大减少，但微流控技术尚未普及，通过显微成像进行判断的技术门槛高、推广难度大、设备成本高，而且基于细菌生长增殖或形态变化的检测机制，无法鉴别处于不生长但有代谢活性(NGMA)状态的细菌，易造成错误判断[参考文献3、4、5]。RNA检测法通过检测细菌在抗生素作用下转录子的变化来判断细菌对药物的敏感性，这种方法前期需要通过大量实验来积累数据并建立数据库，耗时费力，前期成本高，且该方法仅能判断细菌对抗生素是否敏感，而无法定量获得MIC[参考文献6、7]。原子力显微镜悬臂法虽然是通过显微观察、监测抗生素作用下细菌的运动情况来判断细菌的代谢活性(检测细菌的代谢活性可有效鉴别处于不生长但有代谢活性(NGMA)状态的细菌，更准确，但该方法在检测时受各种因素的影响较大(如流动液体、细菌数量等)而无法准确反应细菌活性，且仪器设备极为复杂，对操作的技术要求特别高、检测通量低[参考文献8]。基于拉曼信号的方法也是通过检测细菌代谢活性来判断抗生素的作用效果，这种方法操作简单，测定时间短，但仍存在拉曼信号弱、对部分抗生素的MIC检测不准确、受样品纯度等背景干扰大、信噪比低、与现有仪器兼容性差(不如酶标仪、流式细胞仪等普遍)、价格较为昂贵等问题[参考文献9、10、11]。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于荧光D型氨基酸代谢标记的细菌代谢活性的评估方法和抗菌药敏试验检测方法及其试剂盒，其具有快速、简便、灵敏、准确、直观的特点且与现有仪器兼容性好。本专利技术一方面涉及的基于荧光D型氨基酸代谢标记的细菌代谢活性的评估方法，使用荧光D型氨基酸代谢标记物代谢标记待测细菌，以根据其荧光强度或荧光强度变化来评估生长过程中的细菌代谢活性。本专利技术另一方面涉及的基于荧光D型氨基酸代谢标记的抗菌药敏试验检测方法，荧光D型氨基酸代谢标记物与抗生素溶液共同孵育菌液，检测获得与细菌生长速度和代谢活性正相关的荧光标记信号强度和/或实时检测其荧光信号变化，并根据分析其荧光信号强度获得待测抗生素最小抑制浓度。本专利技术还涉及用于细菌代谢活性评估和/或抗菌药敏试验检测的试剂盒，其包含荧光D型氨基酸代谢标记物，和/或缓冲液、稀释液或载体或培养板、培养皿。附图说明图1是本专利技术实施方式中带有荧光基团的DAA探针的结构示意图；图2是本专利技术实施方式中细菌代谢活性与FDAA的标记强度相关性数据；a为不同温度梯度下与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、地衣芽孢杆菌代谢活性相关的荧光标记强度数据；b为不同时间下地衣芽孢杆菌和大肠杆菌代谢活性相关的荧光标记强度数据。蓝色曲线(实心圆圈)为细菌的生长速率，可表示细菌的代谢活性；红色曲线(实心三角形)为被标记细菌的荧光强度；黑色曲线(横杠)为细菌生长曲线。红色曲线与蓝色曲线具有很好一致性，被标记细菌的荧光强度与细菌的生长速率一致，说明FDAA标记的细菌荧光强度可代表细菌的代谢活性。图3是基于FDAA代谢标记的抗菌药敏试验快速检测方法的流程图；图4是本申请具体实施方式中，苯唑西林(OX)对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)的高水平OX耐药菌株ST5、低水平OX耐药菌株ST59、OX敏感菌株ST398的作用效果。图5是本申请具体实施方式中，万古霉素(VA)对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)的高水平OX耐药菌株ST5、低水平OX耐药菌株ST59、OX敏感菌株ST398的作用效果。图6是本申请具体实施方式中，红霉素(E)对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)的高水平OX耐药菌株ST5、低水平OX耐药菌株ST59、OX敏感菌株ST398的作用效果。图7是本申请具体实施方式中，头孢吡肟(FEP)对革兰氏阴性菌大肠埃希菌(E.coli)的耐药菌株1113、敏感菌株1146的作用效果。图8是本申请具体实施方式中，亚胺培南(IPM)对革兰氏阴性菌大肠埃希菌(E.coli)的耐药菌株1113、敏感菌株1146的作用效果。图9是本申请具体实施方式中，左旋氧氟沙星(LEV)对革兰氏阴性菌大肠埃希菌(E.coli)的耐药菌株1113、敏感菌株1146的作用效果。图10是本申请具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细菌代谢活性的评估方法，其特征在于，使用荧光D型氨基酸(D-amino acid,DAA)代谢标记物代谢标记待测细菌，以根据其荧光强度或荧光强度变化来评估生长过程中的细菌代谢活性。/n

【技术特征摘要】
1.细菌代谢活性的评估方法，其特征在于，使用荧光D型氨基酸(D-aminoacid,DAA)代谢标记物代谢标记待测细菌，以根据其荧光强度或荧光强度变化来评估生长过程中的细菌代谢活性。


2.根据权利要求1所述的细菌代谢活性的评估方法，其特征在于，将荧光D型氨基酸代谢标记物加入到待测细菌中培养以标记待测细菌。


3.根据权利要求1或2所述的细菌代谢活性的评估方法，其特征在于，所述荧光D型氨基酸代谢标记物为D型丙氨酸荧光探针；优选地，所述荧光D型氨基酸代谢标记物包括四甲基罗丹明(TAMRA)DAA荧光探针、带有羧基荧光素(FAM)的DAA荧光探针、带有Cy5的DAA荧光探针。


4.抗菌药敏试验检测方法，其通过评估细菌代谢活性来判断抗生素的抗菌效果和/或细菌耐药性，其特征在于，荧光D型氨基酸代谢标记物与抗生素溶液共同孵育菌液，以检测获得与细菌生长速度和代谢活性正相关的荧光标记信号强度和/或实时检测其荧光信号变化，并根据分析其荧光信号强度获得待测抗生素最小抑制浓度。


5.根据权利要求4所述的抗菌药敏试验检测方法，其特征在于，其步骤包括：一定浓度下的菌液与抗生素溶液混合孵育以在细菌进入生长期后，加入荧光D型氨基酸代谢标记物共同培养。


6.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：王炜，杨朝勇，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31